TESTE DE LABORATOR PENTRU

– MF post-ET
EXPLORAREA HEMOSTAZEI

DR. CRISTINA MAMBET

1
 HEMOSTAZA - INTRODUCERE

Procesul fiziologic de oprire a sângerării la locul injuriei vasculare cu

menținerea fluxului sangvin normal în celelalte teritorii ale circulației

• HEMOSTAZA PRIMARĂ - leziune endotelială → vasoconstricție și

generarea trombusului plachetar (endoteliul vascular, trombocite,
factorul von Willebrand FVW, fibrinogen)

• HEMOSTAZA SECUNDARĂ – activarea factorilor coagulării la

suprafața endoteliului lezat și trombocitelor activate → trombusul
de fibrină → stabilizare sub acțiunea FXIII

• FIBRINOLIZA (HEMOSTAZA TERȚIARĂ) – disoluția

trombusului cu restabilirea fluxului sangvin normal

Gil MR. Overview of the Coagulation System. Transfusion Medicine and Hemostasis, 2019
 HEMOSTAZA - INTRODUCERE

Factori procoagulanți ↔
Sisteme anticoagulante
- Mecanisme de feed-back
pozitiv și negativ

DEZECHILIBRU:

- Sindroame
hemoragipare

- Tromboze
 TESTE PENTRU EXPLORAREA HEMOSTAZEI PRIMARE

1. Numărătoarea automată de trombocite + examenul frotiului de sânge periferic

2. Timpul de sângerare/ Timpul de ocluzie plachetară

3. Determinarea FVW și a fibrinogenului

4. Agregometrie - studiul agregării trombocitelor în prezența a diverși agoniști

5. Analiza prin citometrie de flux – evaluarea receptorilor trombocitari (identificarea unor

disfuncții plachetare)
 VERIFICAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR ANORMALE LA
NUMĂRĂTOAREA AUTOMATĂ A TROMBOCITELOR

● Analiza flag-urilor și a histogramelor indicate de analizor

● Corelarea nr. de trombocite cu indicii trombocitari:

Volumul trombocitar mediu (VTM) Pseudotrombocitopenie indusă de EDTA
Lărgimea distribuției trombocitare (PDW)

● Examinarea frotiului de sânge periferic

- verificarea trombocitopeniei (excluderea pseudotrombocitopeniei!)
- identificarea unor anomalii morfologice ale trombocitelor
sau ale celulelor aparținând celorlalte serii

● Colaborarea cu medicul clinician

5
Anomalie May-Hegglin
 TIMPUL DE SÂNGERARE (TS)

→ utilizat pentru evaluarea in vivo a hemostazei primare

→ măsoară timpul în care plachetele formează un trombus ce astupă o leziune

provocată de înțeparea tegumentului și oprește sângerarea

- metoda Duke: puncționarea lobului urechii → timpul măsurat până la oprirea sângerării
- metoda Ivvy: incizie la nivelul antebrațului după aplicarea brasardei unui tensiometru

→ metodă simplă, nu necesită o procesare a sângelui

→ dezavantaje majore: influențat de diferențele de grosime și temperatură ale

tegumentului, precum și de abilitatea persoanei care efectuează procedura

→ nestandardizat

→ nu se corelează cert cu riscul de sângerare

 TIMPUL DE SÂNGERARE (TS) – SEMNIFICAȚIE CLINICĂ
AAlungit în următoarele situații clinice:

1. Trombocitopenii – dobândite sau ereditare

2. Afectări ale functiei trombocitare

– ereditare: boala von Willebrand, trombastenie Glanzmann, sindrom Bernard-Soulier

– dobândite: uremie, paraproteinemii (mielom multiplu, macroglobulinemia Waldenstrom),

mieloproliferări acute și cronice, infecții virale, insuficiență hepatică severă, medicamente

3. Tulburari ale hemostazei secundare: la 20% din pacientii cu hemofilie, 30% din
pacienții cu deficit de factor V, in unele cazuri de afibrinogenemie

4. Unele boli de tesut conjunctiv: sindrom Ehlers-Danlos

 TIMPUL DE OCLUZIE PLACHETARĂ (PFA-100)
→ TS in vitro

→ PFA-100/Innovance PFA-200 = analizor al funcției plachetare ce utilizează sângele

integral anticoagulat cu citrat de sodiu în condițiile unui stres ↑ de forfecare („shear” stress)

→ sângele trece printr-o apertură tăiată într-o membrană căptușită cu colagen și

epinefrină sau colagen și ADP → plachetele aderă la membrană, sunt activate și agregă
→ astupă apertura

→ timp de ocluzie alungit →

funcție plachetară alterată

→ valoare predictivă negativă ↑

 MODELUL “ÎN CASCADĂ” AL COAGULĂRII

● Fiecare factor al coagulării = proenzimă (zimogen) → enzimă

activă sub acțiunea factorului de coagulare activat situat
“ în amonte”

● Două cascade diferite (calea extrinsecă și calea intrinsecă) care

converg cu activarea FX

● Concordant cu principiul testelor de coagulare in vitro

aPTT, PT (timp Quick, TQ)

● Nu reflectă contribuția celulelor la procesul coagulării

MODELUL “ÎN CASCADĂ” AL COAGULĂRII
 FORMAREA TROMBUSULUI DE FIBRINĂ
Acțiunea trombinei asupra fibrinogenului → clivarea fibrinopeptidelor A și B
→ monomer de fibrină → polimerizare cu formarea polimerilor de fibrină
solubili

Trombina activează FXIII → formarea de legături încrucișate între

monomerii de fibrină → stabilizarea trombusului de fibrină

Key SN. ISTH Bangkok 2017

 TIMPUL DE PROTROMBINĂ – FAZA ANALITICĂ
Reactiv: tromboplastină/CaCl2

Tromboplastina tisulară: vezicule fosfolipidice + TF

Clasic: extract de ţesut animal (creier, placentă, plămân)
Actual: amestec de TF recombinant + fosfolipide purificate (elimină contaminarea cu factori de
coagulare)

Plasmă + reactiv → cheag detectabil mecanic (prin creșterea impedanței sau turbidității) sau optic

Sensibilitatea tromboplastinei comerciale utilizate - ISI (International Sensitivity Index)

1982 – INR: util numai pentru pacienţii cu terapie anticoagulantă orală cumarinică!

INR=2.0–3.0 (2.5): pentru majoritatea situaţiilor clinice

 X
X
 APTT – FAZA ANALITICĂ

Reactiv: tromboplastină "parţială" /activator de contact/CaCl2

Tromboplastina "parţială" : conține doar fosfolipide – cefalină (fără TF!)

Activator de contact: silica, caolin

Plasmă + reactiv → cheag detectabil

- normal: 26-40s
- interval terapeutic: în cursul heparinoterapiei: 1.5-2.5 ori valoarea nivelului de control (probă
recoltată la 3 ore după sau cu o oră înainte de administrarea heparinei nefracționate
 APTT, PT – INTERPRETARE
- PT normal + APTT prelungit: sugerează deficitul unuia din factorii VIII, IX, XI şi/sau XII sau
prekalikreină/kininogen

- PT alungit + APTT normal: sugerează un posibil deficit de factor VII

- PT şi aPTT alungite: sugerează deficitul unuia din factorii I, II, V sau X

Scurtarea aPTT: poate apărea în cazul unor nivele crescute ale unui singur factor, cel mai adesea
FVIII, în neoplasme diseminate (mai puţin când este afectat ficatul), imediat după o hemoragie
acută, în stadiile iniţiale ale CID.
 TT, FIBRINOGEN – FAZA ANALITICĂ

TT

Reactiv: trombină de origine umană/bovină – nu este necesară CaCl2

Variantă: testul de reptilază (se adaugă o enzimă trombin-like extrasă din venin de șarpe)
nu este influențat de prezența PDF sau a heparinei

FIBRINOGEN

- teste imunologice, optice sau funcționale

- METODA CLAUS: - TT modificat
- plasmă diluată + trombină + fosfolipid → timpul de detectare a cheagului
- curbă standard cu ajutorul plasmei de referință
 DETERMINAREA ACTIVITĂȚII FACTORILOR DE COAGULARE

- Se indică de obicei în cazurile de alungire APTT sau PT

- Este evaluat gradul de corecție al timpului de coagulare după adăugarea plasmei de analizat la un sistem
deficitar în factorul ce trebuie măsurat

- Determinarea activității FVIII, FIX – utilă pentru confirmarea dg de hemofilie

- FVIII > 150% se asociază cu un risc ↑ de 5-7 x de VTE şi de 1.5 x de tromboză arterială

- FXIII nu modifică timpii de coagulare efectuați de rutină – necesită a fi recomandat în caz de suspiciune
de deficit ereditar sau dobândit de FXIII (episoade hemoragice cu apari ție tardivă de la traumatismul
provocator, sângerări la nivelul plăgilor operatorii, rar hemoragii cerebrale spontane)

19
INHIBITORII FIZIOLOGICI AI
COAGULĂRII

Margetic S. Biochemia Medica 2012

 ANTITROMBINA, PROTEINA C ŞI PROTEINA S
• anticoagulanţi naturali sintetizaţi în ficat (în cazul proteinelor C şi S sinteza
este dependentă de vitamina K)

• deficitele congenitale sunt rare (<1%)

• un defect genetic al unuia dintre aceşti 3 factori a fost identificat la 5% dintre

pacienţii cu tromboze venoase recurente

• sunt mai frecvente deficitele dobândite

• nu se recomandă recoltarea probelor în cursul unui proces trombotic şi/sau al

tratamentului anticoagulant
Bhattacharjee P, BBhattacharyya D. Intech 2014a
 D-DIMERI – FAZA ANALITICĂ

Reactivi: anticorpi monoclonali împotriva unor epitopi de pe D-dimeri → reacționează specific doar
cu monomerii de fibrină ce prezintă legături încrucișate

Tipuri de teste:
- ELISA și variantele sale automate
- Teste antigen-anticorp cu particule de latex căptușite cu anticorpi monoclonali specifici– manuale
sau automate → citire turbidimetrică

D-dimeri versus Monomeri de fibrină

- Monomerii de fibrină rezultă după eliberarea fibrinopeptidelor A și B din fibrinogen sub
acțiunea trombinei → marker al activării coagulării
- D-dimerii → marker al activării coagulării și fibrinolizei
- Posibil determinarea combinată → dg. precoce al trombozei venoase
 MONITORIZAREA TERAPIEI ANTICOAGULANTE
HEPARINA NEFRACȚIONATĂ – amestec heterogen de lanțuri polizaharidice cu greutate moleculară
variabilă (2000 – 40000 Da); potențează activitatea AT; durată de acțiune scurtă
- activitate anti-FXa/anti-FIIa = 1:1 risc hemoragic major!

TESTE DE MONITORIZARE:

- APTT

- Numărătoarea de trombocite – pentru detectarea trombocitopeniei induse de heparină – reacție

imunoalergică (până la 5% dintre pacienți) după Z5 de tratament; poate fi urmată de complica ții
trombotice

- Determinarea activității de AT – pentru detectarea unui deficit de AT în caz de rezistență la heparină

25
 MONITORIZAREA TERAPIEI ANTICOAGULANTE

HEPARINE FRACȚIONATE (LMWH) – obținute după depolimerizarea enzimatică sau chimică a heparinei
nefracționate; greutate moleculară medie 5000 Da; durată de acțiune mai lungă
- activitate anti-FXa/anti-FIIa = 2-5:1 risc hemoragic mai redus!

TESTE DE MONITORIZARE:

- Test Anti-FXa – se bazează pe un standard internațional anti-Xa UI/ml

- Numărătoarea de trombocite – pentru detectarea trombocitopeniei induse de heparină – reacție

mult mai rară decât în cazul heparinei nefracționate; se efectuează în primele 24 ore de la ini țierea
tratamentului apoi de 2x/săptămână

26
 TESTUL ANTI-FXa
• Principiu:
Plasmă pacient + reactiv: FXa (concentrație cunoscută) + exces de AT
Anticoagulantul va lega AT și inhiba FXa
FXa rezidual va fi invers proporțional cu nivelul de anticoagulant din probă → clivarea
unui substrat cromogen → detecție spectrofotometrică

• Nu se recomandă de rutină
• Indicații: pacienți cu insuficiență renală, gravide (trat. în doze terapeutice), obezi, vârste
extreme
• Recoltarea probei de sânge se face la 3-4 ore de la ultima doză
• Testul poate fi utilizat și pentru monitorizarea tratamentului cu anticoagulante orale noi de tipul
inhibitori direcți anti-Xa (Fondaparinux, Rivaroxaban, Apixaban) cu calibratori și controale
specifice