LP

Explorarea hemostazei primare

Hemostaza fiziologică: proces de apărare cu rol în prevenirea pierderilor de sânge, în urma unei leziuni a
vaselor de calibru mic sau mijlociu, prin formarea unui dop fibrino-plachetar insolubil (tromb).
Fibrinoliza fiziologică: proces de liză a trombusului, cu rol în menținerea sângelui în artere și vene în stare
lichidă și menținerea fluxului sanguin normal.
Echilibrul hemostază – fibrinoliză: se realizează prin funcționarea normală a celor două mecanisme
componente alte acestuia, hemostaza și fibrinoliza. O tulburare fiziopatologică apărută la nivelul uneia dintre
componentele echilibrului fluido-coagulant induce stări de hipo/hipercoagulabilitate, cu posibilitatea
apariției manifestărilor clinice de hemoragie/tromboză
Hemostaza fiziologică se desfașoară în două etape:
 Hemostaza primară (timp vasculo-plachetar),
 Hemostaza secundară (timp plasmatic sau cascada
coagulării)
Activitatea hemostazei depinde de:
• Integritatea sistemului vascular ( musculară,
colagen subendotelial, funcție endotelială)
• Numărul și funcția plachetară
• Factorii plasmatici ai coagularii
• Sistemul fibrinolizei

Leziune vasculară Colagen subendotelial

Stim term

nervoase

vWf

gp Ia/IIa - gpVI gp I b
Vasoconstricție
Aderare Tb

Activare Tb Chemoatractant
TxA Trombocite
2

gp IIb IIIa fibrinogen

Agregare Tb
DOP FIBRINOPLACHETAR

HEMOSTAZA PRIMARA
Intervin:
1. Endoteliul vascular
2. Subendoteliul
3. Plachetele
Aderarea plachetară - punţi între membrana plachetară şi fibrele de
colagen subendotelial, formate din:
- factorul von Willebrand (componentă a factorului plasmatic
VIII);
- rec colagenici specifici pT factorul von Willebrand (FvW);
- rec trombocitari specifici pentru FvW (glicoproteina Ib-IX).
Activarea are loc după ce trombocitele au aderat la fibrele de colagen. Fixarea FvW la nivelul GP-Ib
determină modificări conformaţionale ale lanţului α  transmise prin segmentul intracitoplasmatic la
nivelul enzimelor plachetare  activare
Agregarea plachetară - legături multiple şi punctiforme între trombocite vecine care au aderat la fibrele de
colagen, realizate prin intermediul:
- receptorilor de la nivelul pseudopodelor trombocitelor aderate și activate (GP IIb/IIIa)
- moleculelor de fibrinogen
Explorarea hemostazei primare
Indicațiile efectuării testelor de hemostază sunt:
• Apariția unor sângerări spontane, fără existența unui traumatism
• Apariția de sângerări excesive după extracții dentare, manevre chirurgicale, obstetricale
• Controlul tratamentelor anticoagulante, antitrombotice, fibrinolitice
• Apariția spontană de peteșii, echimoze, purpură
• Prezența unor hemartroze, uneori recidivante
• înaintea efectuării de manevre chirurgicale, obstetricale etc
• Pacienți cu afecțiuni hepatice
• Antecedente heredo-colaterale (boli genetice)
Teste paraclinice folosite pentru investigarea hemostazei primare:
• Timpul de sângerare
• Testul de fragilitate capilară Rumpel-Leeds
• Numărarea trombocitelor
• Frotiul de sânge periferic
• Studiul factorului von Willebrand
• Studiul funcției plachetare
• Dozarea anticorpilor antiplachetari
• Testul de retracție a cheagului
1. Timpul de sângerare (TS)= timpul scurs din momentul apariției primei picături de sânge în urma unei
înțepături și până în momentul în care sângerarea se oprește spontan
Metoda Duke – sângerarea este produsă prin înțeparea lobului urechii sau a pulpei degetului; VN = 2-4 min
Metoda Ivy – leziunea este practicată pe fața anterioară a antebrațului; VN = 4-10 min
 metodă globală de explorare a hemostazei primare.
 nu mai este folosit frecvent în multe țări din cauza dificultății de a îl standardiza și a variabilității mari
- Manșeta unui tensiometru este plasată la nivelul brațului și menținută la 40 mmHg pentru a controla
tonusul capilar și pentru a face metoda mai sensibilă și mai reproductibilă, menținând presiunea
constantă la nivelul capilarelor și ajutând la standardizarea metodei.
- Pielea este înțepată cu un ac steril standardizat, realiz o incizie de 1 mm, pentru a obține sângerarea.
- Leziunea se tamponează cu hârtie de filtru la fiecare 30 sec, pentru a determina când s-a oprit
sângerarea spontan.
Alungirea timpului de sângerare (TS):
A. Vasculopatii - dobândite –fragilitea vasculară asociată diminuării cantității de colagen de la nivel
dermic în purpura senilă
- ereditare –defecte genetice ale receptorilor pentru TGF-b (ce are rol esențial în dezv
normală a v sg) în telangiectazia ereditară hemoragică (b. Osler-Weber-Rendu)
B. Disfuncții ale trombocitelor-trombopatii ereditare: expresia scăzută/abs compl glicoprot Ib/IX/V
în sdr Bernard Soulier (distr trombocitară hemoragică)
- trombopatii dobândite – consum de medicamente cu ef antitrombotic:
 inhibă enz COX-1 (ciclooxigenaza 1) care produce TxA2 (aspirina);
 blochează receptorii trombocitari ai ADP, împiedicând atșarea
adenozindifosfatului și agregarea trombocitelor (clopidogrel)
C. Trombocitopenii – prin defecte de producere – Afectarea capacității proliferative a măduvei
osoase în infecții virale cronice
- prin distribuție anormală – ex. Splenomegalia din bolile hepatice severe
- prin distrucție crescută – ex. Boli autoimune
 D. Boala von Willebrand – prin nivel plasmatic scăzut de FvW sau
- prin sinteza uni FvW disfuncțional
E. Altele
Anemii severe – se modifică distribuția trombocitelor și scade interacțiunea dintre trombocite și
endoteliul vascular
Hipofibrinogenemie – afectarea interacțiunii interplachetare
PFA-100 (platelet function analyzer-100 Valori normale: 78-199 s când se folosesc colagen și epinefrină
55-137 s când se folosesc colagen și ADP
2. Testul fragilității capilare - Rumpel-Leede
 Reprezintă o metodă clinică de apreciere a rezistenței mecanice a capilarelor sanguine prin aplicarea
unei presiuni negative (cu o ventuză) sau pozitive (cu un garou elastic sau cu manșeta tensiometrului)
- manșeta tensiometrului se aplică deasupra plicii cotului sau în treimea superioară a antebrațului,
menținându-se timp de 5 minute la o presiune de aproximativ 90-100 mmHg (valoarea presiunii
arteriale medii).
- Distal de zona aplicării compresiei, presiunea crescută prin staza în sistemul venos și capilar poate
determina efracția capilarelor cu apariția unor hemoragii cutanate punctiforme (peteşii).
- După 5 minute se îndepărtează manșeta .
- Se cuantifică peteșiile cuprinse în aria unui cerc cu diametrul de 20 mm.
o negativ la < de 10 peteșii,
o slab pozitiv între 10-20 peteșii,
o pozitiv la 20-40 peteșii,
o intens pozitiv la > 40 peteșii.
- Dacă în primele 3 minute apar peste 10 peteșii, testul este considerat pozitiv și se întrerupe.
Modificari patologice:
- purpura de natură vasculară (cu etiopatogenie multiplă)
- purpura trombocitară (cu etiologie, patogenie, manifestări clinico evolutive foarte variate).
- Testul nu este modificat în majoritatea tulburărilor de coagulare.
3. Numărarea trombocitelor
 Valori normale :
- Adult : 150.000 - 400.000/μL
- Trombocitopenia : < 100.000 /μL
- Trombocitoza : > 400.000/μL
- Trombocitemie : > 1.000.000/μL
 Trombocitopenia
I. Cauze centrale
a. Hipoproliferare - înlocuirea ţesutului medular cu ţesut tumoral (leucemie, limfom) sau cu ţesut de
fibroză (post-radioterapie, chimioterapie)
b. Trombocitopoieză ineficientă - deficitul de vitamina B12, acid folic
II. Cauze periferice
a. Distribuție periferică anormală- Splenomegalie congestivă (hipertensiune portală),
limfoproliferativă, mieloproliferativă
b. Creșterea distrucției periferice
i. Cauze imune – Purpura trombocitopenică idiopatică/autoimună – datorită existenței în
circulație a autoanticorpilor antitrombocitari, care determină distrugerea prematură a
trombocitelor în ficat și splină.
ii. Non-imunologic –Purpura trombocitopenică trombotică (PTT) și sindromul hemolitic-
uremic (SHU) - multiplii microtrombi în vasele mici de la nivelul inimii, creierului și
rinichilor care produc distrucția non-imunologică a Tb ce traversează zona vasculară
afectată.
PTT – acut la adulți - frecvent idiopatic, uneori în cursul sarcinii sau indusă medicamentos.
SHU – acut la copil– în cursul infecțiilor cu Escherichia coli O157:H7, Shigella dysenteriae.
III. Expresia clinică
 Sângerare muco-cutanată (peteșii, echimoze, epistaxis, urogenital, gastrointestinal) - caracteristic
afectării hemostazei primare.
 Un număr de trombocite >100.000/mm3 asigură o hemostază primară în limite normale, cu un TS
normal și nu se asociază cu hemoragii clinic manifeste.
 Trombocite – 50.000–100.000/μL: sângerare excesivă în traumatisme sev, intervenții chirurgicale ext
 Trombocite < 50.000/μL: sângerare excesivă în traumatisme minore.
 Trombocite < 20.000/μL: sângerare spontană la nivel GI, UG, SNC – uneori cu risc letal.
 Trombocitemia
- Numărul de trombocite din sângele periferic depășește limita superioară a valorilor normale
- Deși în număr ridicat, trombocitemiile pot fi însoțite de hemoragie deoarece trombocitele pot fi
anormale din punct de vedere funcțional (trombopatii), mai frecvent atunci când nr Tr > 1 milion/mm3
I. Cauza primară: – af mieloproliferative ce pot afecta 1/> linii hem (trombocitoza esențială, policitemia vera)
II. Cauza secundară (reactivă):
a. Postsplenectomie - splina este principalul organ care îndepărtează trombocitele îmbătrânite.
b. Anemia feriprivă, anemie posthemoragică : anemia stimulează măduva osoasă pentru producţia
celulară. În absenţa fierului, eritrocitele nu se pot sintetiza uşor, dar trombocitele da.
4. Frotiul de sânge periferic- investigație utilă pentru evidențierea:
 Trombocitopeniei datorate agregării plachetelor –recoltarea sau anticoagularea inadecvată a sângelui
 Morfologiei plachetare anormale –trombocite mari în sdr Bernard-Soulier
 Absenței unor componente ultrastructurale plachetare - lipsa granulelor α în sdr plachetelor cenușii
ORGANITE CELULARE trombocitare:
1. Peroxisomii: conțin enzime implicate în sinteza PLp
2. Mitocondriile – HGlc induce generarea de superoxizi (mec de crestere a a agreagarii Tr in DZ). Au
depozite de GG, pot utiliza AG și aminoaacizii ca surse de energie. Rap ATP/ADP contribuie la
polimerizarea/depolimerizarea actinei
3. Lizozomii: elib în ciculație, în timpul activării, enz (elastaza și colagenaza) ce contribuie la alterări
vasc la locul formării trombilor. Heparitinaza poate rupe moleculele heparin-like de pe suprafața
celulelor endoteliale iar moleculele solubile ce rezultă din acest clivaj inhibă creșterea CMN.
4. Granulele dense (3-8 gran/Tr cu diametrul de 20-30 nm). Densitatea (la ME) derivă din conținutul
lor în Ca2+. Conțin și concentrații mari de serotonină, preluate prin transport activ din citoplasmă.
Acestea (ADP și serotonina) se eliberează din granule în momentul activării.
5. Granulele α sunt cele mai abundente granule: conțin aprox 300 de Pr: b-tromboglobina, FP4 și
proteoglicani., vWf, multimerina și FV, proteine de adeziune, factori de coagulareg, inhibitori de
prooteaze, chemokine, regl de angiogeneză ce provin atât din sint cât și din endocitoză (IG, Fg).
6. Exosomii sunt corpusculi multiveziculari ai membranei interne < decat microparticulele; nu pot lega
factorii de coagulare dar conțin activitate oxidativă- NADPH ce poate genera specii de oxigen active
care contribuie la distrugerea epiteliala în sepsis.
FACTORII TROMBOCITARI AI COAGULĂRII
• F1 = accelerina (identic cu FV plasmatic) reprezintă 20% din totalul de FV; depozitat în granulele α, se
asociază cu multimerina. În momentul activării, se gasește în microvezicule ce sunt eliberate din Tr
promovând coagularea.
• F2 = (fibrinogen activating factor) cu rol de accelerator al acțiunii trombinei
• F3 = fosfolipide din membrana P, echivalent FIII (lecitină)
• F4 = antiheparina proteina cu rol chemotactic și de inhibiție a hematopoezei, angiogenezei și funcției
celulelor T.
• F5 = serotonina
• F6 = fibrinogenul plachetar; se concentrează în granulele α, fiind preluat din plasmă; este o GPr de
adeziune ca și factorul von Willebrand, fibronectina, trombospondina 1, vitronectina amplifică
agregareaTr
• F7 = trombostenina cu rol în retracţia cheagului. Este o proteină contractilă din familia actinelor
• F8 = antifibrolizina plachetară cu rol de antiplasmină
• F9 = factorul stabilizator al al fibrinei, consolidează cheagul de fibrin
 FACTORUL 4 PLACHETAR
 FP4 este o chemokină ce se leagă cu mare afinitate de heparină și poate neutraliza active
anticoagulantă a acesteia. Compl FP4-heparină sunt Ag țintă în trombocitopenia indusă de heparină.
 După eliberarea din Tr, FP4:
 se leagă de moleculele heparin-like de pe suprafața celulelor endoteliale.
 Se leagă de asemenea și de hepatocite care îl catabolizează.
 Este un factor slab de atragere a neutrofilelor și fibroblaștilor.
 Inhibă angiogeneza probabil prin inhibarea proliferării celulelor endoteliale.
 Eliberează histamina din bazofile
 Favorizează maturarea megacariocitelor
 Potențează agregarea trombocitară
5. Studiul factorului von Willebrand
 vWf mediază aderarea plachetară la colagenul expus în urma traumatizării endot prin interm GpIb/IX.
 Cel mai frecvent BvW este ușoară, cu manifestări clinice minore (nu apar sângerări spontane).
I. Metoda aglutinării plachetare cu ristocetină
- ristocetina reprezintă un reactiv agregant folosit pentru studierea fct plachetare (ține locul colagenului)
- în condiții fizioligice, agregarea la ristocetină se produce imediat și depinde de prezența vWf și a
receptorului de pe membrana plachetară, GPIb-IX
- lipsa agregării la ristocetină indică abs vWf (boala von Willebrand) sau a GP Ib-IX (sdr Bernard-Soulier)
- pentru a putea face diferența între BvW și sdr Bernard-Soulier, adăugam vWf (care se găsește în plasma
recoltată de la o persoană sănătoasă)
dacă agregarea se produce, înseamnă ca vWf lipsește și diagnosticul este de BvW
 dacă agregarea nu se produce, GpIb-IX lipsește și diagnosticul este de sindrom Bernard-Soulier
II. Măsurarea Antigenului vWf prin metoda ELISA - măsoară cantit de vWf independent de funcția acestuia.
III. Măsurarea activității factorului VIII plasmatic
- vWf servește ca prot transportoare pt f VIII și niv scăzute de vWf determină și scăderea niv f VIII.
- Raportul normal factorVIII/vWf este de 1:1
- Determinarea vWf poate fi utilă în diagnosticarea la femeie a statusului de purtător de hemofilie A.
- La femeiele purtătoare de hemofilie A (deficit de factor VIII) raportul factor VIII /vWF este de 0,5.
- vWf și factorul VIII cresc în reacțiile de fază acută (stres, afecțiuni minore, traumatisme, inflamații),
sarcină, folosirea de estrogeni, la nou-născuți.
- De aceea, concomitent este indicată și măsurarea unui reactant de fază acută - fibrinogen.
- O creștere a vWf de la nivel uș scăz- lim n în cursul r de fază acută poate masca diagnosticul de BvW.
SÂNGELE este compus din: parte lichidă (apa, subst. organice, subst. minerale solubile) și parte solidă
(leucocite, eritrocite și trombocite). Sângele recoltat:
1. Fără anticoagulant, în eprubetă voi avea 2 straturi: ser și cheag
2. Cu anticoagulant, în eprubetă voi avea 2 straturi: plasma și elemente celulare necoagulate
6. Teste de agregare plachetară
 Peste plasma bogată în trombocite se adaugă reactivi ce stimulează agregarea plachetară - ADP
– epinefrină
- acid arahidonic
- colagen
 Pacienții trebuie să întrerupă medicația cu aspirină sau alte medicamente ce conțin această
susbstanță sau AINS cu cel puțin 7 z înainte – aspirina inhibă agregarea Tb prin inhibarea COX1
 În mod normal, nu există agregare spontană.
 Răspuns normal la test: >60% din trombocite agregate pentru fiecare agonist testat.
 Testul de agregare plachetară este util pentru evidențierea unei discfuncții plachetare.
 Deoarece disfuncțiile plachetare au o prevalență mai scăzută decât alte afecțiuni ale hemostazei
primare, testele de agregare se efectuează dacă testele anterior menționate de explorare a
hemostazei primare sunt în limite normale.
I. Disfuncții plachetare dobândite
- Cel mai frecvent disfuncțiile plachetare sunt datorate medicației.
- Aspirina și compușii înrudiți:
o agregarea la acid arahidonic este abs sau f scăzută, în timp ce celelalte teste sunt afectate var
 II. Disfuncții plachetare ereditare
- Trombastenia Glanzmann – afecțiune rară caracterizată de deficiență a GPIIb/IIIa.
o GPIIb/IIIa mediază agregarea plachetară prin fibrinogen.
o Trombastenia Glanzmann - agregarea plachetară este scăzută pentru toți agoniștii care necesită
legarea fibrinogenului (ADP, epinefrină, acid arahidonic, colagen)
o Răspunsul la ristocetină este în limite normale.

Agregare
Normal
ADP
Colagen

Agregare
Absentă Ristocetină

Agregare Boala von Willebrand

Absentă
Trombastenia Se adaugă plasmă normală cu FVW
Glanzmann Lipsa agregării Bernard-Soulier

7. Anticorpii antitrombocitari
Teste specifice:
• Teste imunologice: Anticorpi monoclonali specifici (monoclonal antibody-specific immobilization of
platelet antigens = MAIPA. Ambele masoara autoanticorpi fata de antigene specifice (complexe GPr)
plachetare de obicei GPr IIb/IIIa si GPr Ib/IX
- Sunt pozitive la 60% din pacientii cu purpura trombocitopenica autoimuna (PTAI).
- Sunt negativi la pacientii cu purpura de alta cauza.
- Datorita costului ridicat sunt folositi in special in scop de cercetare
• Teste Non-specifice
- Măsoară Ig fixate pe Tr. atât pe cei antiplachetari specifici cât și pe cei nespecifici.
- Rezultate pozitive în 90% din cazurile de PTI.
- Poate fi fals pozitivă la pacienții cu alte cauze de trombocitopenii

8. Teste de aderare plachetară

Testele de aderare plachetară investighează funcția plachetară în situația în care timpul de sângerare (TS)
este alungit, numărul de trombocite este normal și nu se produce retracția chegului.
Retracția cheagului reprezintă faza hemostazei primare prin care marginile leziunii sunt apropiate datorită
retracției, facând procesul de vindecare mai ușor.
Retracția cheagului se datorează:
- contracției trombocitelor
- Integrinelor ce ancorează trombocitele de filamentele de fibrină
Metoda Salzman = Metoda Hellem modificată (in vitro): se trece o cantitate de sânge venos, recoltat pe
anticoagulant, printr-o coloana ce contine bile de sticlă.
Se calculează numărul de trombocite înainte și după trecerea prin coloană și se determină procentul de
trombocite care ramân aderate. Daca sunt funcționale, procentul trombocitelor care ies ar trebui sa fie mai
mic decat cel inițial.