EXTRACTIA GAMMAGLOBULINELOR DIN SER SANGVIN PRIN PRECIPITARE CU SULFAT DE AMONIU

Serul sanguin utilizat in aceasta lucrare cu material biologic contine un numar foarte mare de proteine ,
care se separa prin electroforeza pe gel de agar/agaroza sau pe folie de acetat de celuloza in cinci
fractiuni ( albumina , alfa1 , alfa2 , beta , gamma globuline ) .

Fractiunea gamma globulinica a serului contine majoritatea imunoglobulinelor criculante din sange .

Operatia de extractie a gamma globulinelor din ser este motivata de necesitatea separarii si concentrarii
anticorpilor si inlaturarea proteinelor inactive din acest punct de vedere .

Principiul metodei

Gaurile au efecte puternice asupra solubilitatii proteinelor globulare .

Capacitatea sarurilor neutre de a influenta solubilitatea proteinelor este dependenta de

taria ionica , marime ce masoara atat concentratia cat si numarul de sarcini electrice ale cationilor si
anionilor formati de sare .

Pe masura ce taria ionica creste , solubilitatea proteinei incepe sa scada . La o tarie ionica sufficient de
mare o proteina poate fi precipitate aproape complet din solutie , efect numit salifiere .

Proteinele precipitate prin salifiere isi pastreaza conformatia lor native si pot fo dizolvate din nou , de
obicei fara denaturare .

Datorita solubilitatii mari , prin care se poate realiza o tarie ionica foarte mare , se prefera ca sare
precipitate sulfatul de amoniu .

Materiale

Solutie saturata de sulfat de amoniu intr-un balon de 1 l se dizolva 550 g sulfat de amoniu in 600 ml apa
distilata . Pentru dizolvare se incalzeste solutia la 60-90 0C pana cand substanta se dizolva aproape
in totalitate . Se filtreaza solutia fierbinte . Cand solutia filtrata a atins temperatura camerei , se adduce
la 990 ml cu apa distilata . Solutia se prepara cu cel putin 24 ore inainte de folosire . Se neutralizeaza cu
amoniac la pH= ( Observatie : pH-ul va fi determinat numai dupa diluarea solutiei cu apa distilata in
raport 1:10 ) .
Ser fiziologic tamponat , pH=7,4:1 , 792 gr. Na 2HPO4 · 12H2O + 0,22g NaH2PO4 · H2O +8,5 g NaCl se dizolva
in 500 ml apa . Se adduce la pH=7,4 cu Na2HPO4 sau cu NaH2PO4 . Se adduce la 1000 ml cu apa distilata .

Ser sanguin uman nehemolizat .

Mod de lucru

Intr-un balon Erlenmayer care se pune intr-un cristalizor cu gheata se pun 50 ml ser sanguine . Se pune
baia de gheata cu balonul cu ser pe un agitator electromagnetic si se mentine serul 10 min. sub agitare
pentru racier . Se adauga , continuand agiatrea , putin cate putin un volum egal de sulfat de amoniu .
Precipitatul rezultat se lasa in frigider 1 ora dupa care se centrifugheaza 20 min. la 5000 r.p.m.

Se indeparteaza supernatantul iar sedimentul se resuspenda in 50 ml ser fiziologic tamponat . Pentru

indepartarea sulfatului de amoniu , solutia de gamma globuline obtinuta se dializeaza la rece 24 ore
contra serului fiziologic . Controlul se poate face cu reactiv Nessler ( reactie pozitiva pentru NH4+ ) .