Metode imunochimice cu reactivi

marcati utilizate in laboratorul clinic

 TESTE IMUNOLOGICE
• determinari de analiti de interes clinic, care au la baza reactia Antigen –
Anticorp - complexul imunochimic format în urma acestei reactii este
evidentiat si cuantificat ulterior prin intermediul unui marker sau trasor ce
permite masurarea unui semnal specific.
• Antigen
– substanta care induce aparitia unui raspuns imun dupa introducerea
intr-un organism imunocompetent. Are capacitatea de a reactiona in
vivo si in vitro cu anticorpi specifici, independent de calitatea de a
stimula producerea lor.
• Anticorp-
– imunoglobulina cu specificitate fata de un anumit antigen.
• Complexul Ag-Ac
– produsul unei reactii dintre un antigen si un anticorp omolog ce
presupune legarea gruparii determinante de specificitate a antigenului
(epitop) de situsul de combinare al anticorpului (paratop).
 METODE IMUNOLOGICE DE DIAGNOSTIC
 Utilizate atat pentru detectarea antigenelor si a
anticorpilor de interes
• Teste imunologice (immunoassays)
1. teste radioimunologice (utilizeaza marcarea cu radioizotopi) ex.
RIA
2. teste imunoenzimatice (utilizeaza marcarea cu enzime) ex. EIA,
ELISA
3. teste imunologice cu detectie in fluorescenta (utilizeaza
marcarea cu molecule fluorescente (fluorocromi); ex. ELFA, IFA
4. teste imunologice cu detectie in chemiluminiscenta (utilizeaza
marcarea cu molecule care genereaza chemiluminiscenta); ex.
CLIA, ECLIA
Teste imunologice (immunoassays)
 Teste imunologice
• teste imunologie - directe
- indirecte
- de competitie
- sandwich
 Metoda RIA
• utilizeaza marcarea cu radioizotopi; ex.125I care asigura rapiditatea procesului de
conjugare si mentinerea activitatii biologice a reactantilor
• este o metoda mai putin utilizata
• emisia radioactiva (razele gammma pentru 125I) este masurata cu ajutorul unui
scintilator gamma
• pot fi utilizate, ca faza solida, bile de sefaroza sau peretele interior al unor tuburi din
plastic
• Exista doua tehnici RIA principale
1. RIA competitiva - utilizata pentru cuantificarea unor molecule mici, cum ar fi hormoni;
hormonii sunt prea mici pentru a lega mai mult decat o molecula de Ac, astfel incat ei
nu pot fi detectati printr-un test care necesita legarea a mai mult decat un Ac;
 o cantitate cunoscuta de Ag marcat radioactiv si Ag din proba de analizat sunt mixate
si reactioneaza competitiv cu o cantitate constanta de Ac legat de o faza solida
 concentratia de analit este determinata cu ajutorul unei curbe standard (emisii
radioactive pe minut versus logaritmul concentratiei de analit) - cu cat cantitatea de
Ag neradioactiv din proba este mai mare, cu atat radioactivitatea legata este mai mica.
 Metoda RIA
2. RIA necompetitiva sau de tip sandwich – utilizeaza cantitate mai mare de Ac (exces
stoichiometric) legat de faza solida, fiind mai sensibile decat metodele competitive
 Ac legat de faza solida captureaza Ag (analitul) din solutie
 semnalul generat este proportional cu concentratia de analit
 necesita Ag cu mai mult de doua situsuri antigenice
 daca se utilizeaza doi Ac diferiti (care recunosc situsuri antigenice diferite),
protocolul poate fi simplificat (“one step sandwich”), astfel faza solida este mixata
simultan cu Ag din proba si conjugatul
 poate fi aplicata pentru detectia de Ac utilizand Ag ca faza solida si Ag marcat
radioactiv.
Avantaje:
- sensibilitati ridicate (~5 pg/mL)
- usurinta in conjugarea izotopului
- detectia semnalului fara optimizare si stabilitate fata de interferente.
Dezavantaje:
- stabilitatea scurta a reactivului
- necesitatea protectiei antiradioactive
RIA competitiva
 Metode imunoenzimatice
• ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) –
metoda calitativa/semicantitativa
• Principiul ELISA: antigenul sau anticorpul de captura este fixat
pe un suport solid si pus in contact cu o imunoglobulina sau
antigen sau orice alta molecula pentru care are specificitate.
O enzima cuplata, fie direct de imunoglobulina sau de un alt
anticorp anti-imunoglobulina lizeaza un substrat cromogen
rezultand un compus colorat ce poate fi detectat
spectrofotometric la o lungime de unda corespunzatoare
ELISA: test pozitiv si negativ
Met. ELISA
 Cititior ELISA

Spalator ELISA Cititor ELISA

Analizor automat
ELISA
 Metode imunoenzimatice
• EIA (enzyme immunoassay) sau
TIE (test imunoenzimatic) –
metoda cantitativa
EIA automata
 Metode imunoenzimatice

Dinamica anticorpilor in infectia cu Chlamydia trachomatis –determinari prin EIA

 Metoda ELFA
• metoda imunoenzimatica
cantitativa de determinare a
hormonilor, markerilor infectiosi si
virali si a unor autoanticorpi
• metoda imunoenzimatica cu
detectie finala in fluorescenta
• utilizeaza faza solida care capteaza
specific analitul ce urmeaza sa fie
determinat
• analitul ce trebuie determinat
poate fi reprezentat de: antigen
(markeri tumorali, hormoni) sau
anticorpi (IgG, IgM, IgE) ce leaga
specific conjugatul
• se bazeaza pe prietăţile catalitice
ale enzimelor pentru a detecta şi
cuantifica reacţiile imunologice
Met. ELFA – test strip
 ELFA – Principiul metodei
• complexul conjugat – antigen/anticorpi monoclonali/policlonali anti-umani (soarece,
iepure)/derivati de hormoni este marcat cu fosfataza alcalina;
• anticorpul/antigenul specific analitului ce trebuie determinat capteaza
analitul/anticorpul si conjugatul sau formand un complex de tip sandwich;
• componentele care nu se leaga sunt spalate si eliminate in timpul lucrului;
• in ultima etapa, de detectie, substratul 4-methyl-umbellyferyl phosphate este
hidrolizat sub actiunea enzimei conjugatului-fosfataza alcalina si se obtine 4-methyl-
umbellyferone, produs fluorescent a carui florescenta se masoara la 450nm;
• citirea probelor se face de doua ori : prima citire de referinta a cuvei cu substrat se
face inainte ca SRP sa fie indrodus in cuva cu substratul; a doua citire se face dupa
incubarea substratului cu enzima ramasa in interiorul SRP-ului.
• se determina RFV (valoarea florescentei relative); se calculeaza prin diferenta dintre
citirea finala si citirea de referinta;
• rezultatul se calculeaza automat de analizor tinandu-se cont de curbele de calibrare.
Principiul ELFA
ELFA – principiul metodei
ELFA
 Determinari prin ELFA - markeri tumorali
• alfa-fetoproteina (AFP)
• antigenul carcinoembrionar (CEA)
• antigenul tumoral 15-3 (CA 15-3)
• antigenul tumoral 19-9 (CA 19-9)
• antigenul tumoral 125 (CA 125)
• antigenul specific prostatic (PSA)*
• fractia libera a antigenului specific prostatic (Free PSA)
• coriogonadotropina umana (HCG)
*Valori semnificativ crescute ale PSA se intalnesc in prostatite acute/cronice, HBP si
cancer prostatic; important in diagnosticul cancerului de prostata este raportul
FPSA/TPSA
 Determinari prin ELFA - markeri endocrini
• TSH-hormon de stimulare tiroidiana
• FT4- tiroxina libera
• T4 – tiroxina totala
• T3 – triiodotironina totala
• FT3 – triiodotironina libera
• Cortizol
• LH-hormonul luteinizant
• FSH-hormonul foliculo-stimulator
• prolactina
• testosteron
• progesteron
• estradiol II
• ATPO-autoanticorpi anti-tiroid-peroxidaza
• ATG-autoanticorpi anti-tiroglobulina
 Determinari prin ELFA - markeri infectiosi
• anticorpi anti Cytomegalovirus de tip IgM si IgG
• anticorpi anti Toxoplasma gondii de tip IgM si IgG
• anticorpi anti Rubella de tip IgM si IgG
• anticorpi anti Herpes simplex I/II de tip IgM si IgG
• anticorpi anti Helicobacter pylori IgG
• anticorpi anti Epstein Barr virus IgM si IgG
• antigen HBs, antigen HBe
• anticorpi prezenti in HB: anti-Hbe, anti-Hbc total, anti-HBc IgM,
anti-HBs
• anticorpi anti-HCV
• anticorpi anti-HAV totali, anticorpi anti-HAV IgM
 Combinatia dintre VCA-IgG cu
aviditate scazuta cu VCA-IgM
pozitivi & EBNA-IgG negativi - 100%
sigur pentru diagnosticul de
primoinfectie cu EBV

Dinamica infectiei cu EBV

Cinetica anticorpilor Toxoplasma

- IgG avidity
 Determinari prin ELFA - markeri virali
• Pt HB: Ag HBs, Ac anti-HBs, Ag Hbe, Ac anti-
Hbe, Ac anti-HBc total, Ac anti-HBc IgM

Dinamica infectiei virale cu HBV

Determinari prin ELFA - markeri virali
• Pt. HC : Ac anti-HCV
Dinamica
infectiei cu
HCV

•Pt. HA: Ac anti HAV totali, Ac anti-HAV IgM

Dinamica
infectiei cu
HAV
Analizoare de imunologie cu detectie in fluorescenta
 Metoda chemiluminiscenta (CLIA, ECLIA)

• Chemiluminiscenta - este un test imunochimic

ce poate fi aplicat pentru detectia de molecule
mici (haptene), dar si a unor complexe proteice
macromoleculare, ca si pentru Ac fata de
alergeni, agenti infectiosi sau Ag autologe.
• Principala caracteristica consta in marcarea Ag
sau a Ac cu o substanta care genereaza un
semnal ce poate fi masurat, facilitand astfel
detectia complexului Ag-Ac.
 CLIA – principiul metodei

• CLIA (pe Immulite 2000) foloseste ca faza solida

sfere de polistiren imbracate cu anticorpi
specifici. O sfera (bead) este plasata intr-un tub
de reactie special realizat, care serveste ca
recipient pentru produsele de incubare, spalare si
dezvoltare a semnalului.
• Dupa ce proba este incubata cu un reactiv marcat
cu fosfataza alcalina (conjugatul), amestecul de
reactie este separat de pe sfera prin rotatia
tubului de reactie la viteza foarte mare in jurul
axei vertical. Cantitatea de fosfataza alcalina este
proportionala (pentru un test sandwich) sau
invers proportional (pentru un test competitiv) cu
concentratia analitului din proba pacientului.
 CLIA – principiul metodei
• Lichidul este tranferat apoi intr-o camera de suctiune coaxiala care este
integrata in statia de spalare a tuburilor. In decurs de cateva secunde au loc
patru spalari discrete, permitand tuburilor de reactie sa fie procesate
secvential intr-un interval de timp uniform. Sfera ramane astfel in tubul de
reactie fara marker residual nelegat.
• Dupa spalarea tubului de reactie se adauga un substrat luminogenic (adamantil
dioxentan fosfat), iar tubul de reactie este mutat in lantul luminometrului.
• Cinci minute mai tarziu, tubul de reactie ajunge in fata tubului de
fotomultiplicare ( PMT) unde este masurata lumina generata de reactia
luminogenica.
• In cursul reactiei luminogenice substratul este defosforilat intr-un anion instabil
intermediar ce emite un foton de descompunere. Cantitatea de lumina emisa
este direct proportionala cu cantitatea de fosfataza alcalina legata.
 Determinari prin CLIA
• Antigen HBs, Anti-Hbs
• Anticorpi anti H. pylori IgG
• PTH (intact parathormon)
• ATPO, ATG
• TG (tiroglobulina)
• Calcitonina
• IGF1 (Somatomedina C)
• Insulina
• IgE total
• ECP (proteina cationica a eozinofilelor)
• DHEA-S (dehidroepiandrosteron sulfat)
• 17-hidroxi progesteron
• 25 hidroxi vitamina D
• Acid folic
• Vitamina B12
• Etc.
Analizoare cu detectie in chemiluminiscenta
Analizor imunologie ce
utilizeaza ECLIA Principiul met. ECLIA (electrochemiluminiscenta)
 Asigurarea calitatii rezultatelor
• Controlul intern de calitate este un sistem metodologic si organizatoric
menit sa asigure calitatea rezultatelor de laborator, prin decelarea
erorilor sistemice sau intamplatoare si identificarea si inlaturarea
cauzelor care au generat erorile. Controlul de calitate se refera la
precizia, exactitatea si acuratetea in cadrul sistemului.
• Calibrarea este procedeul prin care se testeaza si se ajusteaza un
instrument, un kit, sau un sistem, in conditii specificate, pentru a realiza
o anumita corespondenta intre valorile masurate si valorile cunoscute
ale masurandului.
• Procesul de calibrare consta in testarea materialelor de referinta ,
astfel incat sa se obtina o curba de calibrare (dependenta dintre valorile
cunoscute ale masurandului si indicatiile corespunzatoare furnizate de
instrument) in baza careia sunt calculate rezultatele pentru pacienti.
 Asigurarea calitatii rezultatelor
Validarea controalelor respecta mai multe reguli (sistemul Westgard):
• Regula initiala (2s) – compara valoarea controlului de calitate cu un domeniu egal cu doua
deviatii standard ale domeniului controlului (2s). Daca esueaza se continua cu evaluarea
celorlalte reguli.
• Regula 3s - daca regula 2s va esua sistemul o va compara cu 3s pentru domeniul de control.
Daca aceasta regula esueaza testul va fi marcat ca fiind in afara controlului.
• Regula 2 (2s) – controleaza valorile anterioare si consecutive ale aceluiasi material de
control care depasesc +/- domeniul de control de 2s. Esecul acestei reguli va marca testul
ca fiind in afara controlului.
• Regula 3 (4s) – daca domeniul pentru valoarea cea mai recenta, anterioara, consecutiva,
comparata cu valoarea controlului de calitate curent depaseste 4 SD, testul va fi marcat ca
fiind in afara controlului. Daca testul trece regula se va aplica regula finala.
• Regula 4 (1s) – aceasta regula esueaza daca 4 valori de control consecutive depasesc 1 SD
de aceeasi parte +/- a valorii medii tinta. Testul va fi marcat ca fiind in afara controlului.
Aceasta regula este evaluata istoric si in cadrul aceluiasi material de control si indica
eroarea sistematica.