Metode i tehnici de purificare Metode de precipitare sunt utile pentru concentrarea probelor supuse prificrii i sunt ideale pentru

etapele iniiale de purificare. Pot fi folosite la scar mare i nu sunt influenate de prezena compuilor de interferen, ca n cazul metodelor cromatografice. In solutie , moleculele de proteina sunt foarte puternic hidratate, gruparile ionice de la suprafata acesteia atragand si fixand foarte puternic numeroase molecule de apa. Adaugarea unei cantitati semnificative de saruri , ex. sulfat de amoniu, in solutia ce contine proteina are ca rezultat aparitia unei interactii puternice dintre ionii sarurilor respective si moleculele de apa, inclusiv a celor din vecinatatea moleculelor proteice, efectul final fiind de indepartare a moleculelor de apa din jurul proteinelor aflate in solutie. Acest efect se datoreaza, in parte, densitatii mari de sarcini electrice din compozitia sarurilor comparativ cu cea din structura proteinelor. Aparitia interactiilor dintre ionii sarurilor adaugate in solutia proteica cu moleculele de apa, va elimina in buna parte stratul de hidratare din jurul fiecarei molecule proteice si va favoriza, de data aceasta, interactia dintre moleculele proteice si, implicit, aparitia fenomenului de agregare proteica. Prin adaugarea de cantitati suficient de mari de saruri, acest fenomen se va concretiza prin precipitarea proteinei din solutia apoasa. Proces se numeste salting out si este caracteristic anionilor sarurilor divalente, cum ar fi sulfatul de amoniu. In cazul in care precipitarea se realizeaza la temperaturi scazute (ex. in gheata), proteina va precipita fara a se produce denaturarea acesteia, respectiv mentinerea conformatiei acesteia. Proteina precipitata se poate colecta prin centrifugare. Precipitatul proteic poate fi redizolvat in solutie cu ajutorul unei solutii cu continut scazut de saruri. In acest caz are loc fenomenul invers, respectiv salting in, si anume scaderea concentratiei de saruri din mediu va favoriza stabilirea de interactii intre moleculele de proteina si moleculele de apa, va separa moleculele de proteina unele de celelalte si va restabili solubilitatea proteinei in solutie.
1.

1.1. Precipitarea cu sulfat de amoniu Fenomenul de salting-out n prezena srurilor n mod particular a sulfatului de amoniu, se explic prin faptul c mrirea triei ionice a soluiei determin o reducere a efectelor de respingere dintre moleculele identice ale
1

unei proteine datorit ncrcrii electrice similare. Totodat se reduc i forele ce menin stratul de hidratare din jurul moleculei proteice. Cnd aceste fore sunt suficient de reduse, proteina va precipita, proteinele hidrofobe precipitnd la concentraii de sruri mai mici dect cele hidrofile. Sulfatul de amoniu este cel mai des folosit, fiind preferat datorit solubilitii mari, lipsei de toxicitate fa de cele mai multe enzime, efectului de stabilizare asupra activitii acestora i datorit preului redus al reactivului. Folosirea acestuia la scar mare este, totui, limitat datorit efectului de coroziune, problemelor legate de colectarea precipitatului dup centrifugare i posibilitii de a elibera n mediu amoniac gazos, la valori alcaline de pH. Rezultatele reproductibile pot fi obinute numai n cazul n care se menin constante valorile de pH, temperatur i concentraie proteic. Fracionarea amestecurilor de proteine prin creterea triei ionice este o metod eficient de purificare parial. Ex. Dozare n supernatant Sulfat de amoniu (% de saturaie) 0 Determinare (A280nm) 100 protein 0 Determinare specific (uniti) Observaii Concentraia de sulfat de amoniu se refer la % de saturaie i nu de concentraie procentual a unei soluii obinuite. Pentru a determina aceste procente de saturaie se folosesc tabele speciale sau nomograma lui Dixon. Rezultatele acestui experiment arat c: - la 30% (NH4)2SO4 precipit aproximativ 80% din totalul de protein din prob, dar aproximativ 95% din proteina int se afl nc n soluie; -la 80% (NH4)2SO4 ntreaga cantitate de protein-int este precipitat. Concluziile experimentului: - se adaug 30% (NH4)2SO4, se centrifugheaz i se ndeprteaz precipitatul ce conine ~80% din proteina-contaminant; - se adaug n supernatantul de la prima etap de fracionare (NH4)2SO4 pn se atinge 80% saturaie. Se centrifugheaz i se reine precipitatul ce conine 95% din proteina-int.
2

10 900 200

20 600 200

30 200 190

40 100 170

50 75 100

60 50 30

70 40 5

80 25 0

90 20 0

200

n acest caz concret, factorul de purificare este 5, iar randamentul de purificare 95%. Calculul Activitate specific iniial = 200U/1000mg prot = 0,2U/mg Activitate specific 80% = 190U/175mg prot = 1,08U/mg Factor purificare = 5 Exemplul prezentat reprezint un caz ideal deoarece la concentraii relativ mici de saturaie n (NH4)2SO4 precipit cea mai mare parte dintre proteinele-balast. De obicei, ns, la concentraii mici de (NH4)2SO4 precipit cantiti mici de proteine, cea mai mare parte dintre proteine fiind precipitate la concentraii mai mari. Abordarea prezentat, care se bazeaz pe dozarea cantitativ a proteinei i a activitii specifice n supernatantul obinut pe parcursul etapelor de fracionare cu (NH4)2SO4 este folosit mai rar, datorit interferenelor dintre metodele de dozare (inclusiv metoda Lowry) i ionul de amoniu din soluie. O alt modalitate de abordare, cea mai des folosit, este precipitarea succesiv, dintr-un domeniu de saturaie n altul, i determinarea att a parametrilor de monitorizare, ct i ai parametrilor purificrii prin dozarea proteinei i a activitii specifice n precipitatul obinut la fiecare etap de fracionare. Ex. Fracie saturaie (NH4)2SO4 (%) 0-40 40-60 60-80 supernatant 80% % activ. enzim. precipitat 4 62 32 2 % protein precipitat 25 22 32 21 Factor purificare per etap de fracionare 4/25 = 0,2 62/22 = 2,8 32/32 = 1,0 2/21 = 0,1

n domeniul 40-80% saturaie (NH4)2SO4 se regsete 94% din activitatea enzimatic i 54% din proteina total, cu un factor de purificare de 1,7. Deoarece n fracia 40-60% se obine un factor de purificare mai bun dect n fracia 60-80%, iar activitatea enzimatic recuperat n aceast fracie este aproape de 2 ori mai mare, se trece la o alt variant, modificnd domeniile de fracionare.
3

Fracie 0-45% 45-70% supernatant 70%

% activ. enzim. 6 90 4

% protein 32 38 30

Factor purificare 6/32 = 0,2 90/38 = 2,4 4/30 = 0,1

n fracia 45-70% se recupereaz 90% din activitatea enzimatic i 38% din proteina total, cu un factor de purificare de 2,4, obinndu-se o prob mai nalt purificat dect n cazul precedent. Factorul de purificare din fracia 45-70% este ns inferior celui din fracia 40-60%. De aceea, dac se dorete mbuntirea acestuia se poate continua optimizarea fracionrii. Fracie % activ. enzim. % protein Factor purificare 0-48% 10 35 10/35 = 0,3 48-65% 75 25 75/25 = 3,0 supernatant 65% 15 40 15/40 = 0,4 Se obine fracia cu cea mai mare puritate, factorul de purificare fiind de 3, dar recuperarea este de doar 75%. n funcie de scopul urmrit se poate alege ntre: - varianta cu puritate mare i randamentul mic (n cazul procesul de purificare se oprete n aceast faz, puritatea fiind suficient de mare pentru scopul propus); - varianta cu randament mare i puritate mic (n cazul n care se continu procesul de purificare folosind alte metode). 1.2 Precipitarea izoelectric Similar cu precipitarea cu sulfat de amoniu, aceast metod se bazeaz pe faptul c proteinele precipit cnd nu prezint sarcini electrice la suprafaa moleculei ceea ce se ntmpl la pH izoelectric deoarece reaciile de respingere dintre sarcinile electrice de acelai fel sunt cele care menin proteinele n soluie. n general, fiecare protein este caracterizat de o singur valoare a pH-ului izoelectric. De aceea, aceast metod poate realiza o separare eficient i rapid a proteinelor balast. n practic, dependena de pH a stabilitii proteinei-int este factorul determinant n utilizarea metodei. Pe de alt parte, o serie de limitri ale utilizrii acesteia sunt impuse de posibilitatea de redizolvare a proteinei precipitate la pH izoelectric.

O variant a acestei metode presupune existena n mediul de reacie a unor factori (substraturi sau ali liganzi) care mresc stabilitatea la pH a proteinei-int. 1.3. Precipitarea cu solveni Solvenii acioneaz prin reducerea constantei dielectrice a mediului, ceea ce se traduce prin reducerea solubilitii proteinelor datorit favorizrii interaciilor protein-protein n locul interaciilor protein-solvent. Solvenii utilizai n astfel de purificri sunt metanol, etanol, propan-2-ol, aceton. La fel ca n cazul precipitrii izoelectrice, sunt posibile dou abordri: - precipitarea proteinei-int; - precipitarea prin denaturare i inactivare n prezena solvenilor a proteinelor nedorite, ce sunt apoi ndeprtate. Solvenii organici sunt puin folosii la scar mare datorit costului lor, inflamabilitii, precum i tendinei proteinelor de a se denatura rapid n prezena solvenilor, cnd temperatura depete 00C. 1.4. Precipitarea la cldur Se utilizeaz, n general, pentru ndeprtarea proteinelor contaminate i se bazeaz pe stabilitatea diferit a proteinelor la temperaturi ridicate. Metoda este valabil n cazul n care proteina dorit prezint o stabilitate mare la temperaturi ridicate comparativ cu contaminanii, pentru perioade de timp de la cteva minute la cteva ore. i n acest caz, se prefer prezena unor substane care s protejeze proteina-int. Dializa Dup precipitarea cu (NH4)2SO4 proteina-int se gsete precipitat. Pentru a putea fi analizat i, eventual, continuat procesul de purificare, trebuie ndeprtat concentraia mare de sruri ce se regsete n soluie. Pentru aceasta, se folosete dializa cu membrane semi-permeabile sub form de sculee (membrana se livreaz sub form de tuburi, din care se vor realiza sculee n funcie de dimensiunile necesare). Principala caracteristic a acestor membrane este porozitatea, dar care au dimensiuni ale porilor astfel nct ioni de sruri cu mase moleculare mici pot s treac prin membran, pe cnd moleculele proteice mari nu pot (sunt reinui n scule).

Astfel, membranele de dializ sunt caracterizate prin masa molecular a celor mai mici proteine globulare pe care le rein (cutoff al membranei). Ex: cut-off pentru Spectrapore 6 este 1.000 Da prin membran trec soluii cu mase moleculare mai mici de 1.000 Da. Sculeul de dializ, ce conine proba cu concentraie mare de sruri, este introdus ntr-un tampon cu trie ionic mic. n timp, se atinge un echilibru ntre concentraia soluiilor din interiorul i din exteriorul sculeului. La echilibru, concentraia de sruri din prob se calculeaz astfel: conc. final sruri =
(vol . prob )( conc .saruriprob a ) + (vol .tampon )( conc .tampon ) volumtotal

Not: deoseori concentraia de sruri a tamponului este 0M, respectiv dializa se face fa de ap distilat. Volumul de tampon pentru dializ este determinat de concentraia final de sruri pe care dorim s o avem n prob. Ex: prob 10 ml ce conine 1,0 M NaCl, necesar pentru urmtoarea etap de purificare o concentraie de maxim 1mM NaCl.
(0,01 L )( 0,1M ) + (vol .tp )( 0) = 0,001 M volumtotal
(0,01 L)(1,0 M ) =10 L 0,001 M

volum total =

Volumul de tampon necesar = 10L 0,01L = 9,99L Deci, pentru a dializa 10ml prob cu concentraia de 1,0M NaCl este necesar un volum de aprox. 10L pentru ca proba s aib concentraia final de sruri de 1,0mM. (1:1.000 dializ). Se prefer, ns, dializa secvenial pentru a evita folosirea unor volume att de mari. Ex. I etap: dializ 1:32 310ml tp:10ml prob (1,0M) 31mM conc. final II etap: dializ 1:32 310ml tp:10ml prob 31mM 0,97 mM n loc de a se folosi 10L de tampon, se pot folosi numai 620 ml, atingnd aceeai concentraie de sruri n prob. n schimb, timpul de dializ este de 2 ori mai mare (n general, pentru cele mai multe tipuri de membrane, dializa este complet dup 4 ore). O consecin a faptului c are loc dializa, n timp ce srurile difuzeaz spre exteriorul sculeului, moleculele de ap ptrund n interiorul acesteia. De aceea, volumul sculeului crete (se umfl), iar concentraia de protein scade.

Not n cazuri extreme, umflarea sculeului poate duce la spargerea acestuia, de aceea sculeul nu se umple niciodat la volumul maxim, lsnd un spaiu gol pentru a permite umflarea acestuia. n cazul n care prin dializ concentraia de protein a sczut prea mult se impune concentrarea acesteia, care se poate realiza, tot folosind membrane semi-permeabile. Cea mai simpl metod const n a acoperi sculeul de dializ cu un solut cu mas molecular mare care poate fi dizolvat cu uurin de tamponul din scule. Ex: polietilenglicol sau polivinilpirolidona (m.m. 20.000 Da) sunt uor dizolvai de ap. Astfel, sculeul de dializ acoperit cu polimeri aflai n stare uscat va pierde din ap datorit tendinei apei de a hidrata polimerii, proba concentrndu-se. O alt variant de concentrare presupune ca sculeii de dializ, sub form de disc, ce conin probele s fie supui unor fore de presiune, prin care apa s fie ndeprtat din interiorul acestora n timp ce proteinele rmn n interior. Acelai lucru se poate obine prin centrifugarea discului din membran semipermeabil. Att n cazul dializei, ct i al concentrrii, este esenial ca membrana s nu interacioneze cu proteina-int (de ex. s nu aib afinitate cu aceasta i s lege proteina de pereii sculeului).

2.Metode cromatografice Preparatele proteice clarificate i concentrate pot fi folosite pentru purificare prin metode cromatografice. Pentru purificarea proteinelor/enzimelor exist trei tipuri principale de metode cromatografice: metode de schimb ionic, de afinitate i de excludere din gel (gel-cromatografia), care se folosesc, n general, n aceast ordine. Metodele de schimb ionic i de afinitate cromatografic pot prelucra rapid cantiti mari de extracte brute; prima metod este, ns, mai ieftin i de aceea este preferat pentru primele etape de purificare n care scara de operare este destul de mare. Gel-filtrarea este o metod relativ lent i are cea mai mic rezoluie i capacitate, fiind utilizat pentru etapele finale de purificare, dar i ca metod de schimbare a tamponului de lucru naintea etapelor de concentrare, stabilizare i comercializare. Pentru orice metod cromatografic sunt necesare: - amestecul de proteine: tamponat corespunztor
7

- faza staionar: rin sau matricea - faza mobil: tampon Terminologie Volum total (Vt) (Bed volume) volumul total de solvent i material absorbant din coloan; Volum excludere (V0) (Void volume) volumul fazei lichide Volum de eluie (Ve) (Elution volume) volumul de solvent necesar pentru a scoate un anumit solut din coloan. Rin materialul adsorbant, ce se prezint sub form de pudr uscat sau de suspensie (50% lichid, 50% rin). Mrimea n mesh se refer la numrul de pori din rin per inch2. Cu ct numrul este mai mare, cu att porii sunt mai mici i rezoluia este mai mare. n aplicaii de tipul purificrii proteinelor se folosesc, n general, 100-200 mesh. Matricele cromatografice adecvate separrii i purificrii proteinelor trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: - s aib suprafee disponibile moleculelor de proteine; - s se menin rigide i incomprensiblie n timpul eluiei; - s fie hidrofile i inerte; - s aib dimensiuni standardizate (pentru separri obinuite dimensiunile sunt n domeniul 50-150m; pentru HPLC acestea sunt de 4-6mdiametru). Prepararea rinilor Etape de pregtire a rinilor pentru utilizare presupun: - hidratarea rinilor; - decantarea particulelor fine; - echilibrarea rinei i prepararea suspensiei; - degazarea suspensiei. Hidratarea este necesar n cazul rinilor ce se prezint sub form uscat, de pudr, i se realizeaz prin suspendare n tampon, i hidratare lent peste noapte. Echilibrarea rinei se face n tamponul ce va fi folosit pentru analize. Nu se folosete un magnet pentru agitare, deoarece agitarea mecanic poate produce la spargerea perlelor de rin. Dup echilibrarea rinei i depunerea ei, se adaug un volum egal de tampon pentru a obine o suspensie 50%, care este suficient pentru a elibera bulele de gaz n timpul mpachetrii coloanei. n final, suspensia este degazat nainte de mpachetarea coloanei pentru a minimaliza formarea bulelor de aer.

mpachetarea coloanei Coloanele ce sunt folosite la presiuni mici sunt, de obicei, obinute prin mpachetare sub aciunea gravitaiei. - se adaug o cantitate mic de tampon; - se plaseaz un rezervor la captul superior al coloanei, deoarece se folosete o suspensie de rin de 50%, ce este preferabil s se adauge dintr-o singur manevr, volumul coloanei trebuie s fie suficient de mare pentru ca ntregul volum de suspensie s fie turnat dintr-o dat; - adugarea rinei sub form de suspensie trebuie fcut cu grij pentru a nu se introduce prea multe bule de aer; - se las coloana 5 min pentru a se elima bulele mari de aer; - se deschide valva de la baza coloanei i se permite mpachetarea coloanei sub aciunea gravitaiei; - pe parcursul mpachetrii, nivelul superior al stratului de rin va scdea; mpachetarea este finalizat cnd acest nivel rmne constant. Colectarea probelor Sistemele cromatografice funcioneaz, de obicei, numai sub aciunea gravitaiei, colectndu-se fraciile. Cele mai obinuite sisteme presupun existena urmtoarelor componente: - pompa peristaltic, cu debit variabil, care, n mod obinuit, introduce tamponul n coloan i nu trage probele din coloan. - detector, de obicei, de ultraviolete. - colector de fracii, care permite colectarea fraciilor fie dup numrul de picturi (~30/ml) sau dup timp (corelat cu o pomp controlabil, timpul de colectare poate fi tradus n volum colectat). - recorder ce imprim continuu markerul fraciilor colectate. Probele ce se cromatografiaz sunt, de obicei, n soluii cu trii ionice mici, eluia proteinelor legate fiind realizat prin mrirea triei ionice fie n gradient, fie n etape (trepte). Eluia n gradient se refer la faptul c trecerea de la o concentraie mic de sruri la o concentraie mare se realizeaz printr-o tranziie lent i continu. Proteinele slab legate vor elua primele, pe cnd proteinele puternic legate de rin se vor elua ultimele, necesitnd concentraii mari de sruri care s competiioneze cu ele pentru ocuparea rinii ionice. n cea mai simpl form tehnic, realizarea unui gradient de concentraie presupune existena a 2 vase identice, conectate printr-un tub la baza vaselor. Tamponul din vasul cu concentraia cea mai mic este trimis ctre coloan; pe msur ce acesta prsete vasul, tamponul cu concentraie mare va intra n acest vas, concentraia mrindu-se treptat i linear:
9

Coloan

agitator magnetic Eluia n trepte se realizeaz prin eluarea succesiv a coloanei cu volume de tampoane cu diferite concentraii de sruri. O astfel de eluie este mai rapid i realizeaz eluia proteinelor n volume mai mici dect prin eluie n gradient. Se recomand n cazul n care contaminanii se elueaz la int sau n cazul n care cunoate concentraia de sruri la care elueaz concentraii de sruri foarte diferite de cea la care se face eluia proteinei-aceasta.
Conc. sruri
0

Eluia n gradient

Volum 3 2 1

Eluia n trepte
Conc. sruri

Volum

10

2.1. Cromatografia de schimb ionic Enzimele posed o anumit sarcin electric n soluie, n funcie de valoarea de pH, structura lor i pH izoelectric. n soluii cu valori de pH sub valoarea punctului izoelectric, enzimele vor avea ncrcare pozitiv i se vor lega de schimbtori cationici, pe cnd n soluii cu pH mai mare de punctul izoelectric vor fi ncrcate negativ i se vor lega de schimbtori anionici. Valoarea de pH trebuie s fie astfel aleas nct s menin ncrcarea electric opus a proteinei/enzimei i a schimbtorului de ioni, iar tria ionic trebuie s fie suficient pentru a asigura solubilitatea proteinei, fr ca sarcinile s competiioneze cu proteina pentru situsurile schimbtorului de ioni. Legarea de schimbtorul de ioni este reversibil, iar tria legturii este determinat de valoarea de pH i tria ionic a soluiei, ca i structura enzimei i a schimbtorului de ioni. n mod obinuit, se menine constant valoarea de pH, enzima fiind eluat prin creterea triei ionice a soluiei. Schimbtorii de ioni sunt, n general polimeri insolubili n ap, ce conin grupri cationice sau anionice. - schimbtorii cationici conin grupri anionice: SO3-, -OPO3-, COO-; - schimbtorii anionici conin grupri cationice: grupri teriare i cuaternare de amoniu, cu formula general NHR2+ i +NR3+. Rini schimbtoare de ioni de natur polistirenic sunt adecvate mai ales utilizrii la scar mare a cromatografiei, dar au capacitate mic de reinere a proteinelor datorit dimensiunilor mici ale porilor. Legarea este, ades, puternic datorit hidrofobicitii rinei, iar condiiile necesare pentru eluarea proteinelor sunt destul de severe, ceea ce poate determina denaturarea acestora. Cu toate acestea, rinile polistirenice au un mare potenial n concentrarea sau purificarea enzimelor. Rini schimbtoare de ioni de natur celulozic sunt, n general, mai adecvate purificrii enzimelor, putnd fi introduse diferite grupri anionice sau cationice. Practic, nivelul de substituie al celulozei nu poate s depeasc 1 mol/kg, limit peste care are loc dizolvarea celulozei.

11

Principalele tipuri de schimbtori de ioni Tip de schimbtor Schimbtor slab Schimbtor puternic Schimbtor slab Schimbtor puternic Grupare funcional Contra-ion Na+ Na+ ClDenumire CM (celuloz, sephadex) SP (sephadex) DEAE (celuloz, sephadex) QAE (sephadex)

cationic carboximetil -O-CH2-COOcationic sulfopropil -O-CH2- CH2- CH2SO3anionic dietilaminoetil anionic amin cuaternar (dietil-(2hidroxipropil) amino etil)

Tria unui schimbtor de ioni se refer la gradul de ionizare ntr-un domeniu de pH. Schimbtorii puternici sunt complet ionizai la cele mai multe valori de pH, pe cnd ionizarea celor slabi variaz cu pH-ul. Totodat, schimbtorii puternici au, n general, o capacitate mai mare de reinere. Exemplificare a folosirii schimbtorilor de ioni pentru un amestec de protein, care la pH 7,0 au urmtoarele sarcini electrice: poteina 1 +4 proteina 2 +2 proteina 3 0 proteina 4 -2 proteina 5 -4 Se urmrete purificarea proteinei 4. Etapele procesului de schimb ionic sunt:

a) se alege faza staionar (rina) cu ncrcare pozitiv, i se utilizeaz un tampon de trie ionic mic ce conine grupri negative

12

+ ++ + + +

b) cnd se adaug amestecul de proteine, proteinele ncrcate negativ (4 i 5) vor nlocui ionii negativi ai tamponului i se vor lega de rin

+ + + +

-P -

c) proteine ncrcate pozitiv i neutre nu vor interaciona cu faza staionar i vor trece n volumul de lichid V0 prin eluie; d) dup legarea proteinelor, se adaug un tampon (faza mobil) ce are trie ionic mare (se folosete de obicei NaCl); e) ionii negativi din acest tampon mai concentrat vor competiiona cu proteina pentru sarcinile electrice pozitive ale rinii; f) cnd tria ionic este suficient de mare pentru a dislocui proteina, aceasta va fi eliberat, putnd fi eluat din coloan; g) cu ct sarcina electric negativ a proteinei este mai mare, cu att concentraia ionic a tamponului de eluie este mai mare. n mod obinuit, gradientul de NaCl ncepe de la 0,1M i crete gradual la 0,5 M. Se pot folosi 2 tehnici diferite de operare: I cromatografie pe coloan II operare tip batch I proba se aplic direct pe coloan II- dup pre-echilibrarea schimbtorului de ioni, acesta este amestecat cu soluia de enzime ntr-un vas rcit. Adsorbia este de obicei rapid (30 min). Agitarea amestecului este esenial pentru adsorbia la capacitatea maxim a rinei, dar aceasta nu trebuie s conduc la degradarea mecanic a rinii. Materialul neadsorbit este ndeprtat, iar eluia proteinei/enzimei se face prin adugarea de tampon concentrat direct peste rin. Dup 20-30 minute, se decanteaz tamponul ce conine proteina eluat.

13

Avantajul folosirii tehnicii batch comparativ cu cea pe coloan, const n faptul c se evit problemele legate de compresibilitatea rinii i scderea vitezei de eluii, mai ales n cazul aplicaiilor la scar mare. Avantajul folosirii tehnicii pe coloan este rezoluia mult mai bun. Tampoane ce se utilizeaz n mod preferenial: - pentru rini anionice: TRIS-HCl - pentru rini cationice: HEPES-NaCl Se adaug azid de sodiu 0,02% (antibacterian)

2.2. Gel-cromatografia Denumit i sitare molecular, metoda se bazeaz pe diferenele de mrime ale proteinelor. Perlele de rin prezint mici pori, n care pot difuza moleculele de protein ce sunt suficient de mici. Cele cu dimensiuni mai mari vor rmne n faza mobil i vor fi eluate din coloan. Timpul de retenie al unei proteine depinde de mrimea acesteia. Proteinele cele mai mari vor fi eluate primele, pe cnd cele mai mici, ultimele. Limita de excludere proteina mai mare dect aceast limit nu va penetra n perle i va rmne n faza mobil. Domeniul de fracionare domeniul de mase moleculare ce pot fi fracionate prezint o limit superioar i una inferioar. Se prefer ca eluia proteinei-int s se fac ct mai rapid pentru ca s nu se dilueze staionnd un timp mare n coloan. Mrimea particulelor de gel determin viteza cu care funcioneaz coloana, ceea ce este determinant pentru rezoluie. Mrimea coloanei lungimea trebuie s fie de 20-40 ori mai mare dect diametrul (cu ct este mai lung coloana cu att gel filtrarea se realizeaz mai bine) Mrimea probei volumul maxim de prob este de 1-2% Vt Viteza de curgere cu ct viteza este mai mic cu att rezoluia este mai bun Aplicaii ale gel filtrrii 1) Purificarea unei proteine dintr-un amestec 2) Determinarea masei moleculare a unei proteine - un amestec cunoscut de proteine, avnd mase moleculare bine determinate se aplic pe o coloan (ex. Sephacryl S 100) 1. Ribonucleaz A 13.700 2. Chimotripsinogen A 25.000 3. Ovalbumina 43.000
14

4. Albumin seric bovin 67.000 5. Blue Dextran 2.000.000 - V0 se determin folosind Blue Dextran ca marker - Vl se determin pentru fiecare din celelalte proteine - Vt se calculeaz din formula Vt = r2xh - constanta de difuzie, kav se calculeaz pentru fiecare protein dup formula kav= V V t 0 - valorile kav obinute se reprezint grafic n funcie de logaritmul masei moleculare a proteinelor, obinndu-se curba standard a coloanei. - proteina cu mas molecular necunoscut este trecut pe aceeai coloan, calculndu-se kav i raportndu-se valoarea obinut pe curba standard se extrapoleaz valoarea masei moleculare. 3) ndeprtarea srurilor dintr-o prob se folosete o coloan cu limit de excludere foarte mic, cum ar fi G10 (limita 700 Da), astfel nct orice protein cu masa molecular de 1000 Da va trece prin coloan, fr s fie reinut. n schimb, srurile, ce au kav mari, se vor elua foarte ncet. 2.3 Cromatografia de afinitate n prezent, este un termen ce definete generic o varietate de metode de purificare a enzimelor ce au n comun faptul c se stabilesc interacii mai mult sau mai puin specifice ntre enzim i un ligand imobilizat. Cea mai specific form de ligand este substratul enzimei sau un inhibitor competitiv. Ca o alternativ, se poate folosi drept ligand un anticorp. Matricile specifice sunt costisitoare i nu pot fi folosite pe scar mare. n general, prin cromatografie de afinitate se obin valori mari ale factorului de purificare (n medie, x10). O abordare mai puin specific, dar adecvat pentru multe enzime este folosirea de analogi ai coenzimelor, cum ar fi NAD+, drept ligand. n unele cazuri se folosesc n loc de coenzime diferii colorani drept liganzi, care prezint avantajul c sunt mult mai ieftini i prezint, n mod surprinztor, specificitate pentru diverse enzime. O alt variant de cromatografie de afinitate, este cromatografia interaciilor hidrofobice, n care caz ligandul este un spacer arm de natur hidrofobic, cum ar fi grupri octil sau fenil. Interaciile hidrofobice sunt puternice la trii ionice mari, de aceea trebuie s fie dializate nainte de a fi aplicate pe adsorbant. Eluia se realizeaz prin modificarea de pH sau trie ionic sau a constantei dielectrice (ex: prin adugare de etandiol).
Vl V0

15

Testarea puritii proteinei purificate a) La sfritul procesului de purificare, se testeaz gradul de puritate al proteinei prin electroforez n gel de poliacrilamid (PAGE polyacrylamide gel electrophoresis). Metoda realizeaz separarea proteinelor pe baza ncrcrii electrice a acestora, n condiiile meninerii activitii lor biologice, ceea ce permite evidenierea acesteia prin metode colorimetrice. n acest mod, se relev activitatea specific a enzimei purificate. Prin compararea poziiei benzii acesteia cu benzile evideniate prin colorare pentru proteinele totale din prob, se poate determina dac proteina/enzima este pur sau nu. Astfel, dac apare o singur band pe gel de electroforez, care corespunde att colorrii specifice proteinei, ct i a activitii enzimei, atunci proteina purificat este omogen. n cazul n care apar maimulte benzi proteice, dar o singur band enzimatic nseamn c proteina/enzima-int mai este nsoit, nc, i de alte proteine contaminate. b) Determinarea proprietilor biochimice c) Determinarea masei moleculare a subunitilor prin SDS-PAGE sau PAGEdenaturat: metoda presupune denaturarea proteinei n prezena unui detergent, SDS (sodium dodecilsulfat) i a unui reductor tiol (2-mercaptoetanol) care scindeaz punile disulfurice (Cys-S-S-Cys). Detergentul SDS se leag de catena polipeptidic, ceea ce i confer o sarcin electric negativ uniform. n acest fel, toate proteinele vor avea aceeai ncrcare electric, iar n timpul electroforezei SDS-PAGE singurul criteriu de separare a proteinelor va fi mrimea acestora datorit efectului de sitare al gelului. Astfel, polipeptidele cu mase moleculare mari, respectiv subunitile proteinei denaturate, se vor regsi n captul superior al gelului PAA deoarece vor migra foarte puin n timpul PAGE, pe cnd polipeptidele cu mase moleculare mici se vor regsi spre captul inferior. Mrimea subunitilor proteinei testate poate fi determinat prin folosirea unei curbe de calibrare, realizat prin migrarea n gel, n condiii experimentale identice, a unor proteine standard, cu mase moleculare ale subunitilor lor cunoscute. d) Compoziia n subuniti a proteinei: se determin prin mprirea masei moleculare a proteinei native la masa molecular a subunitilor. (masa molecular a proteinei native se determin prin gel-filtrare). proteina este un Ex: m.m. protein nativ = 80.000 Da dimer m.m. subunitate = 38.000 Da n cazul n care proteina este un monomer, atunci m.m. protein nativ = m.m. subunitate. Unele proteine sunt compuse din 2 subuniti diferite i, de aceea, prin analiza SDS-PAGE se vor regsi 2 polipeptide.
16

Pentru analiza SDS-PAGE se folosete numai protein pur. n concluzie: Se folosesc 2 tipuri de PAGE: 1) PAGE nativ pentru determinarea puritii 2) SDS-PAGE pentru determinarea masei moleculare a subunitilor Exist 2 tipuri de mase moleculare: 1) m.m. a proteinei native determinat prin gel-filtrare 2) m.m. a subunitilor determinat prin SDS-PAGE Compoziia n subuniti a proteinei: m.m. protein nativ/m.m. subuniti = nr. subuniti din protein (nr. ntreg)

17