5 Tehnici Bio Molec PDF

Biologie Celulara si Histologie
Curs 5 Tehnici de biologie moleculara

si inginerie genetica
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara
Cuprins
The Human Genome project

Tehnici de genetica moleculara
Secventierea acizilor nucleici
PCR
Clonarea unor gene
Vectori
Transfectii
Animale transgenice; linii knock-out
Aplicatii ale ingineriei genetice
The human genome project
The human genome project
Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 2003
Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health

Partener major: Wellcome Trust (UK)
Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc
The Human Genome Project
Obiective
Identificarea tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-

25000)
Determinarea intregii secvente de nucleotide din ADN-ul
uman (aprox. 3 miliarde)
Crearea unor baze de date cu aceste informatii
Perfectionarea de instrumente pentru analiza and
Transferul tehnologiilor catre sectorul privat
Identificarea problemelor legale si etice care pot aparea
si propunerea de solutii
Continutul informational al genomului uman
Probleme speciale legate de identificarea si localizarea
genelor
Centromerii contin secvente cu grad inalt de repetitivitate,

dificil de mapat cu tehnicile actuale
Telomerele contin la randul lor secvente repetitive, de multe
ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului
Existenta multigenelor locusuri cromozomiale care contin
gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat
individual
Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent;

studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia
actuala
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
Cromozomul 1
Cel mai mare dintre

cromozomii umani; contine
aprox. 8% din informatia
genetica
Boli genetice:
Parkinson
Alzheimer
Charcot-Marie Tooth
(neuropatie ereditara)
In cancer apar frecvent
modificari ale regiunilor sale
terminale
Cromozomii 2 si 4
Au cea mai mica rata de recombinare

dintre cromozomii umani
Cromozomul 2 unic prin provenienta

(fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)
Cromozomul 4:
Boala Huntington
Boala polichistica
Cromozomii 3, 5, 6
Cromozomul 3
Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala
Zone implicate in diferite cancere
Cromozomul 5
Redundanta informationala mare, continut genetic
scazut
Implicat in atrofia musculara spinala
Cromozomul 6
Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t
(activitate transcriptionala)
Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate
Cromozomii 7, 8, 9
Cromozomul 7
Gena CFTR - implicata in fibroza chistica
Cromozomul 8
Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii
creierului la primatele mari
Cromozomul 9
Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie
de sex mascul femela)
Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc
Cromozomii 10, 11, 12, 13
Cromozomul 10 Cromozomul 11
Tumori, boli Unul dintre cei mai
neurologice bogati in gene
Numarul cel mai
mare de gene ptr
receptori olfactivi
Leucemii, limfoame, Contine gena
alte cancere cancerului de san
(de tip II)
2 gene asociate
diabetului Contine gena
asociata
Gene implicate in
retinoblastomului
tulburari psihiatrice
Gene pentru ARNr Unul din cromozomii
in bratul scurt cu rata mare de
duplicare
segmentala
Duplicare Cea mai mare
segmentala mare diferenta de
structura dintre un
Gene implicate in
cromozom uman si
boala polichistica
cromozomi similari
renala, leucemii
mamalieni
acute
Translocarea 14-18 Gene implicate in
este una din cele hipercolesterolemia
mai comune cauze familiala si diabetul
genetice de cancer insulino-rezistent
la oameni
Contine gene Cel mai mic
prionice (boala cromozom
Creutzfeld-Jacob) O copie
Implicat in diabetul suplimentara
zaharat de tip II, (trisomie) determina
obezitate, cataracta, sindromul Down
boala Graves
Cromozomii 22, X, Y
Cromozomul 22
Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice
Cromozomul X
Cromozomul sexual feminin
Cromozomul Y
Cromozomul sexual masculin
Exemplu cromozomul 21
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml
Baze de date
NCBI Human Genome Sequencing Progress

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/
University of California (Santa Cruz)
http://genome.ucsc.edu/
Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute &
EMBL-European Bioinformatics Institute
http://www.ensembl.org/
EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's
Nucleotide Sequence Database)
http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html
Aplicatii, beneficii din urma HGP
Medicina moleculara:
Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala
Design rational de medicamente
Terapie genica
Farmacogenomica
Aplicatii energetice si de ingineria mediului

Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili,
sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului
Bioarheologie si antropologie
Medicina legala
Agricultura
Genetically modified foods (GMF)
Patentarea genelor, secventelor genetice
Se poate face atunci cand:
Este identificata o noua secventa genetica
Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective
Este specificata functia produsului respectiv
Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care
poate fi utilizata de specialisti din domeniu
Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani

Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii
referitoare la produsul patentat
Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in
USA etc):
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml
Tehnici de genetica moleculara
Secventierea ADN
Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea
secventei de nucleotide intr-un lant de and
Metode de baza:
Secventierea chimica (Maxam Gilbert)
Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea
lantului la nivelula cestor modificari
Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADN-
proteine etc)
Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de
ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si
nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent
Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin
electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV
Alte metode de secventiere
Electroforeza capilara
Dye-termination method Clonare in vectori bacterieni
Secventierea ADN
Metoda shotgun
Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici

Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care
difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa
ulterioara)
Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel
Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul
aceleiasi benzi de migrare in gel
Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment se recreaza astfel secventa
originala de A T C G pentru fiecare fragment
Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o
cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate
Dupa citirea bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este
analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.
Exemplu (principiu de baza)
PCR = polymerase chain reaction
Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN
Necesita:
Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat
Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale
lantului de ADN
ADN-polimeraza
Nucleotide
Buffer, ioni divalenti
Utilizare:
Secventializarea ADN-ului (citirea informatiei genetice)
Clonari
Scopuri diagnostice
Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica
Scopuri criminalistice
PCR
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf
Clonari de gene
Clonari de gene
Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si
realizarea de copii multiple ale acesteia
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf
Vectori
Sunt molecule de ADN utilizate pentru transferarea de
material genetic strain intr-o celula
Tipuri de vectori:
Plasmide
Bacteriofagi, alte virusuri
Cromozomi artificiali
Transferul de material genetic intr-o celula =

Transfectie
Plasmide
Fragmente de ADN dublu

spiralat, de obicei circulare
Capabile de autoreplicare
Se pot integra sau nu in
genomul celulei gazda
Origine bacteriana / sinteza in
vitro
Utilizare in transfectii, terapie
genica
Wikimedia Commons
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf
Vectori virali
Bacteriofagi virusuri care infecteaza bacterii
Retrovirusuri se integreaza in genom, se replica o data cu
celula gazda
Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)
Adenovirusuri nu se integreaza in genom, nu se replica o
data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns
imun puternic utilizare in crearea de vaccinuri)
CONDITII DE UTILIZARE:
Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene

Toxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza
Stabilitate sa nu prezinte mutatii frecvente
Specificitate pentru o anumita linie celulara
Vectori virali
Bacteriofag
Vector lentiviral
Wikimedia Commons
Wikimedia Commons
Cromozomi artificiali
Cromozomi de drojdie (YAC yeast artificial

chromosome)
Cromozomi bacterieni (BAC)
Cromozomi umani (HAC) functioneaza ca un
cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la
diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea
in celula de gene noi
Transfectii
Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu

ajutorul unui vector
Metode:
Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a
membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula
Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!)
Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele
celulare
Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in
celule prin endocitoza
Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.
Utilizarea de vectori virali:
Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat
genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule
Animale transgenice
Crearea, in scopuri de
cercetare, a unor linii de
animale de laborator (soareci,
sobolani etc), ce prezinta o
anumita mutatie a unei gene
Utilitate:
Modele pentru anumite boli
Studierea implicarii anumitor gene
in anumite lanturi de control, in
aparitia anumitor maladii Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003
Generation of YAC-transgenic mice
Kenneth R. Peterson
Linii knock-out
Linii de organisme modificate genetic
(de obicei soareci), la care una sau
mai multe gene au fost blocate de la
expresie
Utilizate in studiul patogeniei unor boli
Wikimedia Commons Wikimedia Commons
Screening genetic
Vaccinuri
Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)
Terapie genica
GMF/O
Screening genetic
Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane

Aplicatii:
Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o
gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)
Diagnostic prenatal
Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli
genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)
Medicina legala
Terapie genica
Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa

inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice
Cum se introduce gena?

Vectori:
Retrovirusuri
Adenovirusuri
Virusuri herpes simplex
Terapia genica
Probleme actuale de rezolvat:

Durata scurta a efectului in prezent, integrarea genei in genom
este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie
Controlul raspunsului imun declansat de prima sedinta de terapie,
accentuat la repetarea sedintei
Probleme speciale legate de vectorii virali efecte adverse nedorite
(raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun,
posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul
gazdei)
Bolile multigenice dificultati in identificarea tuturor genelor
implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea
tuturor regiunilor de genom implicate
Terapia genica
Rezultate semnificative in prezent:
2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical
Research Centre ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de
cecitate
2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas
Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica +
tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a
volumului unor tumori pulmonare
2006: National Cancer Institute (NCI) au obtinut limfocite modificate genetic care ataca
cu succes celule tumorale de melanom malign
2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame
mieloide
2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin
introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare
Alte rezultate promitatoare deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator
sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei
chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc
Farmacogenomica
Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza
raspunsul organismului la medicamente
http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm
Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

5 Tehnici Bio Molec PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

5 Tehnici Bio Molec PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biologie Celulara si Histologie

Curs 5 Tehnici de biologie moleculara

The Human Genome project

Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 2003

Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health

Identificarea tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-

Centromerii contin secvente cu grad inalt de repetitivitate,

Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent;

Cel mai mare dintre

Au cea mai mica rata de recombinare

Cromozomul 2 unic prin provenienta

NCBI Human Genome Sequencing Progress

Aplicatii energetice si de ingineria mediului

Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani

Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

Dye-termination method Clonare in vectori bacterieni

Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici

Transferul de material genetic intr-o celula =

Fragmente de ADN dublu

Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene

Stabilitate sa nu prezinte mutatii frecvente

Specificitate pentru o anumita linie celulara

Cromozomi de drojdie (YAC yeast artificial

Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu

Wikimedia Commons Wikimedia Commons

Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane

Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa

Cum se introduce gena?

Probleme actuale de rezolvat:

Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

S-ar putea să vă placă și