IMUNOFENOTIPARE LIMFOCITARĂ – PROFIL DE BAZĂ

SynevoImunofenotipare limfocitară – profil de bază

336 Lei
În București se efectuează marți și joi.
Informaţii generale despre sistemul imun
Funcţia primară a sistemului imun este aceea de a lupta împotriva agenţilor patogeni microbieni
(bacterii, paraziţi, fungi, virusuri). Sistemul imun îndeplineşte această funcţie în două moduri: în primul
rând, prin generarea unui răspuns imun specific împotriva agentului patogen invadant şi controlul
infecţiei; în al doilea rând, prin reamintirea acestui prim “conflict” şi declanşarea unui răspuns imun
accelerat în urma reexpunerii la acelaşi agent patogen microbian3.
Sistemul imun este constituit dintr-o reţea complexă de celule, ţesuturi şi organe care participă
împreună la apărarea organismului uman.
Cunoaşterea structurii şi funcţiei complexe a sistemului imun ajută la înţelegerea fundamentului
deficienţelor imune congenitale sau dobândite (infecţia HIV) şi la perceperea căilor potenţiale prin care
sistemul imun poate fi modulat în cazul unor boli specifice3;9.
Organele limfoide ale sistemului imun sunt:
 măduva osoasă hematogenă (situsul hematopoiezei),
 timusul (centrul “instructajului timic”, de maturare a protimocitelor in celule T mature), splina
(„filtrul” imunologic al sângelui),
 nodulii limfatici (centrul imunologic al limfei),
 ţesutul limfoid asociat mucoaselor (MALT) şi
 ţesutul limfoid asociat tractului digestiv (GALT)9;11.
Intr-o manieră similară, macrofagele şi celulele dendritice de la nivelul splinei şi nodulilor limfatici
capturează antigenele şi le prezintă limfocitelor B şi T, declanşând astfel răspunsul imun.
Celulele sistemului imun sunt:
 limfocitele T,
 limfocitele B,
 celulele NK,
 granulocitele,
 macrofagele/monocitele,
 fibroblaştii,
 celulele epiteliale,
 celulele dendritice3;9.
Majoritatea agenţilor patogeni au o capacitate de proliferare foarte ridicată, iar prevenirea infecţiilor
sistemice necesită răspunsuri adecvate şi rapide din partea sistemului imun înnăscut şi a sistemului imun
dobândit11.
Imunitatea nespecifică/înnăscută asigură prima linie de apărare împotriva agenţilor microbieni
patogeni11.
Se caracterizează prin răspunsuri imune nespecifice, rapide şi la fel de intense, indiferent de tipul
agentului patogen, care destul de rar sunt suficiente pentru a elimina în totalitate infecţiile microbiene
celulare şi prin lipsa memoriei imunologice sau a unei imunităţi protective de durată. Este asigurată prin
intermediul barierelor anatomice (tegumente, membrane, mucoase), barierelor fiziologice (temperatura,
pH), factorilor chimici (interferoni, sistemul complement), celulelor cu activitate fagocitară
(macrofage/monocite, celule dendritice, neutrofile, fibroblaşti, celule epiteliale), citotoxicitaţii mediate
celular (celulele NK)3;9.
Prin producţia de mediatori (citokine, chemokine, interferoni), răspunsurile imune nespecifice stabilesc
“scena“ pentru declanşarea răspunsurilor imune specifice11.
Imunitatea specifică/dobândită/adaptativă este acea funcţie a sistemului imun de a recunoaşte specific
antigenele şi de a dezvolta o imunitate mediată umoral, o imunitate mediată celular sau ambele,
principalii “ jucători” fiind anticorpii, limfocitele B, limfocitele T şi celulele prezentatoare de antigen.
Acest tip de imunitate poate fi dobândită activ (organismul gazdă produce proprii anticorpi/limfocite
imunologic active, iar imunitatea este de lungă durată) sau pasiv (organismul primeşte
anticorpi/limfocite imunologic active produse în timpul unui răspuns imunologic activ în alt organism,
iar imunitatea este de scurtă durată). Indiferent că este vorba despre o imunitate activă sau pasivă, aceasta
poate fi dobândită natural (anticorpii sunt produşi în organismul gazdă sau primiţi prin transfer
placentar/alăptare) sau artificial (prin vaccinare)9.
O carateristică importantă a acestui tip de imunitate este memoria imunologică.
Răspunsurile imune adaptative sunt larg extinse prin stimulare antigenică, ceea ce conduce la
expansiunea clonală, diferenţierea şi maturarea a diverse clone de celule B antigen specifice, pentru a
produce anticorpi circulanţi (răspuns imun umoral), şi prin activarea celulelor T, derivate din timus, la
răspunsuri imune celulare antigen specifice. Practic, imunitatea adaptativă depinde de reţeaua de
interacţiuni foarte complexe şi intricate dintre diferitele tipuri celulare şi subseturile lor, reglate prin
producţia lor de mediatori (citokine, chemokine si interferoni tip I,II )11.
Celulele sistemului imun înnăscut constituie o rezervă celulară uniformă fără specificitate antigenică;
pot fi recrutate în număr remarcabil de mare; sunt primele care ajung la locul infecţiei; modelul de
migrare este unidirecţional, iar odată exercitată funcţia lor, celulele vor fi eliminate. În cazul celulelor
specifice sistemului imun dobândit (limfocitele), acestea sunt prezente într-un număr scăzut pentru un
anumit antigen şi, pentru a contrabalansa acest dezavantaj, ele urmează un mod complex de migrare,
strâns dependent de statusul lor de activare şi memorie imunologică. Prezintă deci capacitatea de a
recircula: reintră în circulaţia sangvină de la nivelul ţesuturilor limfoide şi migrează către un situs la
distanţă. Migrarea limfocitelor este bine organizată pentru a asigura o expunere eficientă a acestora la
antigenele lor înrudite de la nivelul organelor limfoide secundare. Mai mult, clonele limfocitare care
prezintă anumite caracteristici relevante, cum ar fi receptorii care recunosc epitopii antigenici, nu sunt
pierdute după implicarea în răspunsul imun, în schimb sunt rezervate ca “celule cu memorie” pentru a
asigura răspunsuri imune specifice mai rapide şi mai puternice, în cazul reinfecţiei cu acelaşi agent
patogen11.
Celulele prezentatoare de antigen (APC) reprezintă un grup de celule heterogen din punct de vedere
morfologic şi funcţional, provin din precursori medulari şi sunt specializate în a prezenta antigenele
limfocitelor, în special celulelor T. Aceste celule profesionale prezentatoare de antigen includ monocite
(prezente în sângele periferic), macrofage (monocite tisulare), celule rezidente de la nivelul organelor
limfoide ale sistemului imun (celule dendritice) şi constituenţi ai sistemului monocit-macrofag din alte
organe solide. Limfocitele B, care captează antigenul prin intermediul receptorilor de tip mIg
(imunoglobuline de membrană), pot de asemenea să funcţioneze eficient ca APC pentru limfocitele T,
prin prezentarea antigenului degradat (oligopeptid) legat de moleculele complexului major de
histocompatibilitate (MHC); limfocitele T activate vor secreta citokine care vor dirija diferenţierea
limfocitelor B şi producţia de anticorpi a acestora. Caracteristica definitorie a acestor celule este
exprimarea moleculelor MHC I şi II pe suprafaţa lor, precum şi a moleculelor accesorii necesare pentru
activarea limfocitelor T: CD86 şi CD80. Imediat după activare, APC pot sa secrete citokine care induc
funcţii specifice în celulele cărora le prezintă antigenul. Monocitele şi macrofagele sunt fagocitic active,
exercitand această funcţie în special asupra antigenelor acoperite de anticorpi sau de componente ale
sistemului complement care se leagă de receptorii de suprafaţă pentru Fcγ şi C3b11;12.
Moleculele de legare a antigenelor, prin capacitatea lor de a lega antigenele străine organismului uman,
sunt responsabile de specificitatea răspunsului imun dobândit. Există trei seturi de astfel de molecule:
imunoglobuline (Ig), receptorul celulelor T (TCR) şi moleculele MHC, toate aceste molecule făcând
parte din superfamilia de imunoglobuline (IgSF). Ig sunt alcătuite dintr-un lanţ polipetidic greu (H) şi
un lanţ usor (L), de tip kappa sau lambda; acestea sunt exprimate pe suprafaţa limfocitelor B şi secretate
ca anticorpi în cadrul răspunsului imun umoral. TCR se prezintă sub forma unui heterodimer alcătuit
din 2 lanţuri polipeptidice H – αβ/γδ; majoritatea limfocitelor T exprimă αβ-TCR. Genele HLA situate
pe cromozomul 6 codifică moleculele complexului major de histocompatibilitate MHC I şi II.
Moleculele MHC I sunt formate dintr-un singur lanţ H (HLA-A, B, C), spre deosebire de moleculele
MHC II care sunt alcătuite din două lanţuri H – α şi β (HLA-DQ, DR, DP). Limfocitele T care exprimă
pe suprafaţa lor receptori αβ-TCR pot fi divizate în două subpopulaţii majore. Această împărţire este
bazată pe clasa de molecule MHC recunoscută de receptorii αβ-TCR şi de expresia moleculelor CD4
sau CD8, care prin ataşarea de moleculele MCH contribuie la completarea legăturii moleculare
intercelulare. In timp ce limfocitele CD4 recunosc antigenul legat de moleculele MHC I, limfocitele
CD8 recunosc antigenul legat de moleculele MCH II; raportul limfocitelor CD4/CD8 în sângele periferic
este aproximativ 2:1 (0.8:1-3:1). Toate celulele nucleate exprimă molecule MHC I şi sunt APC non-
profesionale, APC profesionale exprimând molecule MHC II. Interacţiunea dintre complexul MHC-
peptidul antigenic şi TCR deţine un rol esenţial în protecţia imună, deoarece un răspuns imun complet
necesită intervenţia celulelor T antigen specifice. Acesta reprezintă practic un mecanism de siguranţă
pentru a minimaliza posibila auto-reactivitate (reactivitate împotriva self-ului), astfel încât un limfocit
T devine activat numai pentru că a întâlnit un antigen străin (non-self).
Limfocitele B provin din celulele stem hematopietice care, în mod succesiv, populează splahnopleura
embrionară paraaortică, ficatul fetal şi măduva osoasă hematogenă. Celulele stem fiice dau naştere
progenitorilor limfoizi multipotenti (PLM), care generează celulele mieloide sau limfoide. Astfel, PLM
pot produce precursorii limfoizi comuni (PLC), iar aceştia pot genera limfocitele T, limfocitele B,
celulele NK şi un subset special de celule dendritice. Diferenţierea finală spre celulele B necesită ca
celulele fiice PLC să fie expuse unor micromedii specializate, aşa cum sunt cele prezente în ficatul fetal
şi măduva osoasă. Trecerea de la ficatul fetal la măduva osoasă începe la mijlocul vieţii fetale şi se
termină chiar înainte de naştere; celulele B continuă să fie produse în măduva osoasă pe parcursul
intregii vieţi. Diferenţierea celulelor B are loc în două stadii, diferite din punct de vedere anatomic şi
funcţional; astfel, primul stadiu are loc în măduva osoasă şi este antigen independent, iar cel de-al doilea
stadiu are loc în organele limfoide periferice şi este antigen dependent9;11.
Limfocitele B imature, care exprimă pe suprafaţa lor mIgM (imunoglobulina de membrană) şi BCR
(receptorul celulei B), părăsesc măduva osoasă după un proces de selecţie negativă a celulelor B auto-
reactive şi pătrund în periferie (sânge şi organe limfoide secundare) unde îşi completează diferenţierea
în celule B mature care exprimă pe suprafaţa lor mIgM şi mIgD şi pot fi activate prin legarea de
antigen11.
Celulele B imature auto-reactive, ce exprimă mIgM self-reactiv, urmează un proces cunoscut ca
“receptor editing“, în care un rearanjament la nivelul genelor care codifică lanţul greu al
imunoglobulinelor (IgH) modifică specificitatea antigenică a receptorului. Dacă acest proces eşuează,
celulele B imature auto-reactive devin anergice sau vor suferi apoptoza în urma contactului cu antigenul.
Aceasta contrastează cu abilitatea celulelor B mature de a deveni activate în urma contactului
antigenic12.
BCR este un complex format dintr-o mIg şi două molecule citoplasmatice Igα/CD79a şi Igβ/CD79b. Cu
ajutorul acestui receptor limfocitele B recunosc antigenul şi devin astfel activate. Implicarea BCR
iniţiază o serie de evenimente care culminează cu diferenţierea celulelor B în plasmocite capabile să
secrete imunoglobuline. Limfocitele B vor prezenta antigenul, recunoscut cu ajutorul BCR, limfocitelor
T helper CD4 care au fost activate anterior de acelaşi antigen, limfocitele T helper fiind selectate din
pool-ul de limfocite T naive de către celulele dendritice prezentatoare de antigen. Acest proces de
activare a limfocitelor B, dependent de limfocitele T, are loc prin interacţiunea dintre CD40 de pe
suprafaţa celulelor B şi ligandul sau, CD145, de pe suprafaţa celulelor T helper şi prin secreţia de
interleukina-4 (IL-4) de către celulele helper. Ambele semnale servesc la promovarea şi menţinerea
activării iniţiate de BCR11.
La nivelul organelor limfoide secundare – în zonele bogate în celule T – celulele B naive, după
stimularea antigenică, urmează o expansiune clonală şi formează grupuri de celule B activate (focare
extrafoliculare). Acestea se pot diferenţia în plasmocite de scurtă durată (secretoare de anticorpi cu
afinitate joasă) sau migrează înapoi în foliculi şi iniţiază formarea unui centru germinativ.
După proliferare şi maturaţie, celulele B din centrul germinativ se pot diferenţia în plasmocite de lungă
durată şi celule B de memorie. Majoritatea plasmocitelor de lungă durată migrează în măduva osoasă şi
sunt răspunzătoare de menţinerea nivelului seric de anticorpi (anticorpi de înaltă afinitate); celulele B
de memorie pot rămâne pentru o lungă perioadă de timp la nivelul organelor limfoide secundare sau pot
migra şi habita în măduva osoasă11;12. În urma contactului antigenic, celulele B de memorie răspund
printr-o proliferare rapidă şi diferenţiere în plasmocite, refăcând astfel rezerva de celule B de memorie
şi plasmocite.
Prin dezvoltarea tehnologiei anticorpilor monoclonali, analiza anumitor molecule de pe suprafaţa
celulelor B (CD = “cluster determinants”) a ajutat la definirea stadiilor care se succed pe parcursul
întregului proces de diferenţiere şi maturaţie a celulelor B (vezi tabelul 17.9.1.1):
Celule Celule Celule Celule Celule B Celule B Celule B Plasmocite Celule B
Stem Pro-B Pre-B pre- imature mature activate de
Blate memorie
 CD34 ++ ++
CD10 ++ ++ ++ ++ ++
CD19 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
CD20 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
CD21 + + + + ++ ++ ++
CD24 ++ ++ ++ ++ ++ + +
CD38 ++ ++ ++ ++ ++
CD27 ++ ++
Tabel 17.9.1.1 Markeri pentru diferenţierea celulelor B
Limfocitele T citotoxice (CTL) şi celulele NK
Aceste două tipuri celulare, distincte din punct de vedere fenotipic, dar strâns legate prin funcţia lor
citolitică (“killer”), sunt importante atât în controlul infecţiilor, cât şi în identificarea şi eliminarea
celulelor tumorale. Celulele CTL sunt limfocite T CD8+ care îşi îndeplinesc funcţia de “killer“ prin
două căi majore: liza mediată de perforine şi granzime ce sunt eliberate din lizozomi şi apoptoza receptor
indusă (TNFR), ambele căi necesitând un contact apropriat între celula litică şi ţinta sa, în special prin
interacţiunea dintre TCR şi moleculele MHC I. Răspunsul CTL la o infecţie acută are loc în trei faze:
prima constă în activarea iniţială şi proliferarea CTL; a doua în contracţia celulelor T efectoare în celule
T de memorie; iar a treia fază se referă la menţinerea de lungă durată a pool-ului de celule T de memorie.
Celulele CTL se dezvoltă la nivelului timusului, părăsesc acest organ limfoid în stare naivă, circulă între
organele limfoide secundare (splina şi ganglionii limfatici) pe calea sistemului arterial, respectiv
limfatic, şi în cursul acestui pasaj întâlnesc antigenul nonself. Antigenul este adus la nivelul organelor
limfoide secundare prin sistemul limfatic de către celula dendritică (APC); aceasta devine matură după
achiziţia antigenului nonself la nivelul ţesuturilor non-limfoide. Deşi celula dendritica este cel mai
important APC profesional, macrofagele şi celulele B sunt de asemenea capabile să prezinte antigenul.
Procesul infecţios conduce la o creştere dramatică a CTL patogen/antigen specifice, iar magnitudinea
acestui proces depinde de natura infecţiei şi de inoculul/doza de antigen. Această expansiune este urmată
de contracţia CTL efectoare în celule T de memorie. Un procent de 5% din populaţia celulelor efectoare
expansionate supravieţuieşte sub forma celulelor de memorie de lungă durată. Este prevenită astfel
afectarea tisulară nespecifică ce se poate produce prin activitatea citolitică şi eliberarea necontrolată de
citokine şi este asigurată flexibilitatea CTL de a răspunde la noi infecţii.
Producţia de celule de memorie antigen, independentă de lungă durată este esenţială pentru un răspuns
rapid în cazul unei reinfecţii. CTL de memorie asigură un răspuns mult mai intens decât celulele CTL
naive activate primar, atât din punct de vedere cantitativ cât si calitativ. Deoarece în cursul infecţiei
primare CTL suferă o expansiune clonală importantă, numărul de precursori CTL antigen specifici este
mult mai mare la indivizii imunizaţi comparativ cu cei naivi, ceea ce permite un răspuns imun mai
puternic. CTL de memorie prezintă o eficienţă extraordinară în elaborarea funcţiilor efectoare prin
producţia rapidă de gamma-interferon (IFNγ).
Compartimentul CTL de memorie este compus din două tipuri celulare: CTL de memorie-efectoare
(Tem) şi CTL de memorie-centrale (Tcm), acestea din urmă fiind capabile de o auto-reinnoire antigen-
independentă homeostatică prelungită. La întâlnirea cu antigenul, aceste celule dobândesc rapid funcţia
efectoare şi fenotipul celulelor Tem. Celulele CD4 şi citokinele IL-15, IL-7, IL-2 şi GM-CSF (factorul
de stimulare al coloniilor pentru granulocite şi monocite) au un rol important în supravieţuirea şi
menţinerea rezervei de CTL de memorie (vezi tabelul 17.9.1.2).
În final, activitatea citotoxica a CTL are loc prin două mecanisme:
• citolitic: dependent de producţia de granzime (A, B) si perforine;
• non-citolitic: dependent de producţia de citokine (IFNγ si TNF-α) care au capacitatea de a inhiba
proliferarea agenţilor patogeni intracelulari11;12.
MARKER CTL naive Tem Tcm
 CD44 + +++ +++
Distribuţia tisulara Ganglioni limfatici, Tesuturile non-limfoide Ganglioni limfatici,
principala splina, sange (plaman, ficat), splina splina, sange
Funcţia citotoxica – ++ –
IFNγ – +++ +
Tabel 17.9.1.2 Proprietăţile CTL
Celulele NK aparţin liniei celulare limfoide şi sunt implicate în răspunsul imun înnăscut. În comparaţie
cu CTL, celulele NK sunt de talie relativ mare, granulare şi nu necesită pre-activare pentru a recunoaste
şi a liza celule tumorale sau aberante. De asemenea nu au nevoie de prezenţa moleculelor MHC I. Aceste
celule sunt capabile să producă cantităţi importante de citokine şi chemokine, care le permit să moduleze
răspunsul imun. IL-15 este necesară pentru a menţine nivelul homeostatic al celulelor NK in organism,
activitatea de „killer” fiind exercitată în acelaşi mod ca şi în cazul CTL.
Receptorii celulelor NK sunt clasificaţi în activatori si inhibitori şi aparţin la două familii importante de
receptori: killer cell immunoglobulin-like (KIR) şi lectin-like. Prin receptorii inhibitori celulele NK
recunosc moleculele MHC I de pe suprafaţa celulei ţintă şi primesc astfel un semnal inhibitor – no-
killing; prin receptorii activatori recunosc liganzi celulari, virali sau induşi de stres, care transmit un
semnal activator – pro-killing. In cazul în care o celulă ţintă nu exprimă moleculele MHC I pentru a
evita acţiunea citolitica a CTL, aceasta va fi distrusă de către celula NK.
Celulele NK se afla într-un număr relativ redus la nivelul măduvei osoase şi splinei (<2%) şi reprezintă
aproximativ 15% din numărul total de limfocite din sânge. NK sunt de obicei definite prin intermediul
unei combinaţii de markeri de suprafaţa celulară (CD): CD3-, CD16+, CD56+. Astfel pot fi clasificate
în două subseturi, în funcţie de exprimarea CD16 şi CD56:
• NKCD56dimCD16bright reprezintă >90% din NK din sângele periferic, exprimă nivele mari de KIR
şi activitate citotoxică/citolitică mare (secreţie crescută de perforine/granzime);
• NKCD56brightCD16dim se caracterizează printr-o producţie mai mare de citokine, potenţial
proliferativ mai înalt şi reprezintă principala populaţie celulară NK de la nivelul organelor limfoide
secundare11;12.
Celulele T helper-CD4, în mod similar celulelor TCR+, se diferenţiază la nivelul timusului din celulele
progenitoare comune limfoide, în cea mai mare parte în timpul vieţii fetale şi imediat după naştere.
Iniţial, celulele T nu exprimă TCR şi sunt CD3-/CD4-/CD8- (triplu negative). Etapele de diferenţiere
timică includ stadiile:
• preTCR CD3+/CD4-/CD8- (dublu negative);
• TCR CD3+/CD4+/CD8+ (dublu pozitive);
• în ultima etapă, celulele T al căror TCR recunoaşte antigenul prezentat de moleculele MHC II devin
TCR CD3+/CD4+, iar cele al căror TCR recunoaşte antigenul prezentat de moleculele MHC I devin
TCR CD3+/CD8+.
Celulele T naive, pozitive pentru un singur CD (CD4 sau CD8) părăsesc timusul şi recirculă din sânge
în ariile timus-dependente (TDA) ale organelor limfoide secundare. În majoritatea răspunsurilor imune,
activarea celulelor T CD4+ are loc în TDA ale organelor limfoide secundare, iar celulele prezentatoare
de antigen sunt reprezentate de celulele dendritice. Prezentarea eficientă a antigenului non-self
stimulează activarea, proliferarea şi diferenţierea limfocitelor CD4+ în trei categorii funcţionale: celule
CD4+ cu activitate proinflamatorie, celule CD4+ cu activitate reglatoare/antiinflamatorie şi celule
CD4+ ce funcţionează ca celule de memorie. Diferenţierea dintre celulele T naive, efectoare şi de
memorie se face pe baza moleculelor exprimate pe suprafaţa lor (vezi tabelul 17.9.1.3).
Celulele CD4+ efectoare sunt cele care susţin procesele inflamatorii prin eliberarea de citokine, fiind
divizate în trei categorii: Th1 , Th2, Th1711;12.
Celulele T reglatoare (Treg)
Pentru a preveni răspunsurile imune auto-distructive şi a permite cele protective împotriva antigenelor
non-self, sistemul imun a dezvoltat o serie de mecanisme reglatoare care au rolul de a inhiba generarea
de limfocite T şi B self-reactive potenţial dăunătoare – toleranţa imună centrală – şi de a scădea activarea
celulară şi expansiunea limfocitelor atunci când acestea întâlnesc antigene self – toleranţa imună
periferică.
Au fost descrise mai multe tipuri de celule T cu activitate reglatoare: celule T TCRγδ +, celule NK,
limfocite T CD8+ şi limfocite T CD4+.
Celulele T CD4+ reg pot fi divizate în două categorii: celulele Treg care apar natural (generate în timus)
şi celulele Treg induse (Treg 1 care secretă IL-10, Th3 care secretă TGFβ), diferenţiate din celulele T
naive. Celulele T CD4+ reg derivate din timus sunt CD25+ şi se găsesc într-un procent de 30%, însă
doar 2-4% din celule Treg CD25high+ au proprietăţi supresive. Un alt marker important este factorul
de transcripţie FOXP3 care este exprimat în mod specific la nivelul celulele Treg timic derivate.
Majoritatea celulelor FOXP3 + sunt celule CD4+CD25 bright+ şi doar câteva sunt celule CD25- şi CD25
low+11.
Celulele T de memorie
Nivelul protecţiei imune se corelează cu numărul de celule T de memorie antigen specifice. In cursul
infecţiei primare există o expansiune importantă a rezervei de celule T CD4+ şi celule T CD8+ specifice
antigenului patogen. Numeroase studii demonstrează faptul că mărimea rezervei de celule T de memorie
depinde de mărimea „exploziei” de celule T antigen specifice din timpul fazei de expansiune. Celulele
T de memorie pot fi clasificate în: celule T centrale de memorie şi celule T efectoare de memorie.
Trebuie reţinut că celulele T de memorie pot prolifera şi produce citokine ca răspuns la o stimulare cu o
cantitate mai mică de antigen, cu o costimulare mai slabă şi mult mai rapid comparativ cu celulele T
naive. In plus, ele pot promova şi intensifica funcţia APC şi accelera activitatea celulelor T naive.
În absenţa stimulării antigenice, celule T de memorie pot suferi o proliferare homeostatică pentru a-şi
reface rezerva. Celulele T de memorie CD4+ şi CD8+ îşi pot păstra responsivitatea lor rapidă în absenţa
stimulului antigenic şi sunt capabile să confere o imunitate protectivă11;12.
MARKER Celule T naive Celule T efectoare Celule T de memorie
CD62L H L H/L
CCR7 H L H/L
CD45RA H L H/L
CD45RO L H L/H
Tabel 17.9.1.3 Markeri pentru diferenţierea celulelor T
H = exprimare marcată; L= exprimare slabă
Profilul imun de bază şi recomandări pentru efectuarea acestui test
În cadrul profilului de bază sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută principalele
subseturi de limfocite implicate în răspunsul imun, prin identificarea markerilor de suprafaţă specifici
(moleculele CD):
– limfocitele totale (CD45+);
– limfocitele T (CD3+);
– limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
– limfocitele T supresoare/citotoxice (CD3+/CD8+);
– raportul CD4+/CD8+;
– limfocitele T imature CD3+/CD8+/CD4+ ;
– limfocitele B (CD19+);
– celulele NK (CD3-/CD16+/CD56+).
Principala aplicaţie a determinării subclaselor limfocitare este screening-ul, evaluarea şi monitorizarea
deficienţelor imune, caracterizate prin infecţii recurente, unele ameninţătoare de viaţă, ce pot fi
bacteriene, virale şi/sau fungice în funcţie de natura deficienţei.
Imunodeficienţele primare (congenitale) sunt afecţiuni rar întâlnite, cu o frecvenţă estimată la 1/10000
naşteri vii, în schimb mult mai frecvente sunt imunodeficienţele secundare din boli maligne limfo-
reticulare, boli autoimune, tratamente imunosupresoare, infecţii virale, deficienţe nutriţionale, boli cu
pierdere de proteine.
Deficienţele imune celulare pot fi numerice sau funcţionale, putând fi implicate neutrofilele sau
limfocitele. Pe baza hemogramei poate fi depistat un număr scăzut al uneia din clasele de leucocite, însă
numărul total de limfocite este inadecvat pentru investigarea unei deficienţe imune, fiind necesară
cuantificarea separată a principalelor subseturi limfocitare B, T si NK prin citometrie în flux.
Pentru identificarea deficitelor imune celulare funcţionale sunt disponibile teste funcţionale.
Sunt descrise peste 200 tipuri de imunodeficienţe primare, aproximativ 170 dintre ele având defecte
genetice identificate. Heterogenitatea clinică şi imunologică a acestor afecţiuni face ca diagnosticul să
fie dificil, necesitând corelarea datelor clinice şi radiologice cu teste imunologice şi genetice.
Imunofenotiparea limfocitară cu determinarea cantitativă a subseturilor de limfocite face parte dintr-un
spectru complex de teste diagnostice ce pot fi efectuate prin citometrie în flux, cum ar fi identificarea
unor proteine anormale specifice unei anumite boli, precum şi teste funcţionale, acestea constituind în
general apanajul unor laboratoare specializate.
Informaţiile obţinute pe baza imunofenotipării, în corelaţie cu alte date clinice şi de laborator, permit
selecţia testelor ulterioare necesare pentru diagnosticul de certitudine, în special teste genetice.
– Imunodeficienţa comună variabilă (CVID) include un grup heterogen de boli, având prevalenţa cea
mai mare între imunodeficienţele primare. CVID se caracterizează prin anomalii ale limfocitelor B, au
prezentare bimodală, în copilăria timpurie, respectiv între 15-40 ani, 4 mutaţii genetice diferite fiind
asociate cu aceasta. Pacienţii se prezintă cu infecţii sino-pulmonare recurente, hipogamaglobulinemie
globală şi număr de limfocite B normal sau scăzut, 5-10% din pacienţi prezentând niveluri foarte scăzute
ale limfocitelor B (<1% din leucocite).
Un subset de pacienţi (5-10%) dezvoltă granuloame non-cazeoase sarcoid-like în diferite organe şi o
deficienţă progresivă a limfocitelor T, în unele cazuri cu număr de limfocite T CD4+ <200/μL.
Dintre toţi pacienţii cu CVID, 25-30% prezintă un număr crescut de limfocite T CD8+ şi raport
CD4+/CD8+ scăzut (<1).
– Agamaglobulinemia se caracterizează prin debut la vârsta de 4-6 luni, cu infecţii sino-pulmonare şi
gastro-intestinale recurente, hipogamaglobulinemie globală, număr foarte scăzut sau absenţa
limfocitelor B circulante, incapacitatea producerii de anticorpi ca răspuns la antigene, inclusiv vaccinuri,
hipoplazia ţesuturilor limfoide secundare.
În 85% din cazuri prezintă transmitere X-linkată şi se caracterizează prin defecte ale expresiei Btk
(Bruton`s tyrosine kinase) pe limfocite, monocite şi trombocite ca urmare a unor mutaţii la nivelul genei
BTK.
Agamaglobulinemia X-linkată poate fi confundată cu CVID la adulţi datorită suprapunerii principalelor
caracteristici, însă numai 5% din cazurile de CVID prezintă <1% limfocite B CD19+ circulante.
Confirmarea diagnosticului se bazează pe evaluarea prin citometrie în flux a proteinei Btk, respectiv
identificarea mutaţiei la nivelul genei BTK.
– Imunodeficienţa severă combinată (SCID) este un sindrom cu potenţial letal, caracterizat prin infecţii
recurente, dermatită, diaree şi eşecul suptului. Este cauzat de defecte moleculare numeroase, care
determină anomalii numerice şi funcţionale ale limfocitelor B, T şi, ocazional, NK, dar în majoritatea
cazurilor limfocitele T sunt absente sau prezintă niveluri foarte scăzute. Pe baza unui algoritm bazat pe
prezenţa sau absenţa limfocitelor B şi NK la pacienţii cu niveluri foarte scăzute sau absenţa limfocitelor
T, se pot selecta testele ulterioare necesare pentru stabilirea diagnosticului. Diagnosticul corect permite
instituirea promtă a tratamentului şi, în ultimă instanţă, transplantul de măduvă osoasă care asigură
supravieţuirea pacientului.
Un exemplu de SCID este sindromul Ommen, caracterizat prin diferenţierea parţială a limfocitelor T
datorită unei mutaţii hipomorfe la nivelul genei RAG1 (recombinase activating gene 1) sau RAG2. La
aceşti pacienţi, spre deosebire de pacienţii cu mutaţii care determină pierderea completa a funcţiei genei
şi la care lipsesc complet limfocitele B si T, păstrează o activitate recombinantă V(D)J parţială şi pot
genera o cantitate substanţială de celule T oligoclonale. Totuşi limfocitele B sunt complet absente şi, în
ciuda unui nivel crescut de IgE, nu poate fi detectat un răspuns de anticorpi antigen-specifici. Clinic
sindromul se caracterizează prin dermatită, diaree, limfadenopatie, hepatosplenomegalie şi
susceptibilitate extremă la infecţii. Pacienţii prezintă limfocitoza prin prezenţa unui set de celule TH2
oligoclonale activate antigen-stimulate, precum şi eozinofilie.
Deficienţa MHC clasa a II-a (iniţial cunoscută ca sindromul limfocitelor goale) este o formă de SCID
caracterizată prin absenţa expresiei moleculelor MHC II pe suprafaţa celulară, cu număr normal de
limfocite B şi T, dar număr scăzut de limfocite T CD4+. Pentru precizarea diagnosticului, prin citometrie
în flux poate fi demonstrată absenţa moleculelor MHC clasa II de pe suprafaţa celulelor prezentatoare
de antigen, respectiv limfocitele B sau celulele de linie monocit-macrofag.
– Sindromul DiGeorge este o imunodeficienţă primară cu o frecvenţă de 1/3000 naşteri vii, caracterizată
prin hipocalcemie datorată hipoparatiroidismului, defecte cardiace şi hipoplazie sau aplazie timică.
 Acesta este cunoscut sub diferite nume: sindromul velo-cardio-facial, sindromul Shprintzen, CATCH
22, anomalia facială conotruncală, toate reprezentând aceeaşi condiţie genetică, respectiv deleţia
cromozomului 22q11.2, care poate avea expresie clinică diferită. Sindromul DiGeorge “complet” cu
absenţa totală a timusului şi imunodeficienţă severă reprezintă <0.5% din pacienţi. Majoritatea
pacienţilor au un defect parţial cu alterarea dezvoltării timusului şi anomalii variabile ale limfocitelor T,
cu o incidenţă crescută de infecţii şi boli autoimune. Imunodeficienţa se datorează numărului scăzut de
limfocite T, al celulelor T reglatoare naturale (nTreg), şi, deşi numărul total de limfocite B este normal,
este scăzut numărul limfocitelor B de memorie.
Alte indicaţii ale imofenotiparii limfocitare – profil de bază sunt:
 Monitorizarea imună după terapie imunosupresoare pentru transplant, boli autoimune, boli neoplazice.
 Utilizarea majoră a imunofenotipării în transplant este reprezentată de monitorizarea tratamentului cu
globulina anti-timocitară, un nivel de celule T CD3+ de 50/μL fiind considerat pragul pentru tratament.
 Evaluarea reconstituirii imune post-transplant de celule stem hematopoietice.
 Determinarea numărului absolut de celule B circulante la pacienţii cu leucemie limfoidă cronică, o
valoare de >5×109/L fiind necesară pentru diagnosticul de LLC conform ghidurilor 2008 pentru
diagnostic şi tratament în LLC.
Specimen recoltat – sânge venos5.
Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant5.
Volum probă – 5 mL sânge3.
Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul
şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei5.
Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate
sau congelate5.
Metodă – citometrie în flux5.
Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor
Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei
pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute5.
Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de factori
biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile circadiane
au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp ce limfocitele
CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în cursul după-amiezei.
Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populaţiilor limfocitare se recomandă
ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al zilei8.

Bibliografie:
1. ARUP Laboratories. Test Directory: Lymphocyte Subset Panel 5 – Total Lymphocyte Enumeration.
www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
2. Christopher S. Baliga, Mary E. Paul, Javier Chinen, William T. Shearer. HIV Infection and Acquired
Immunodeficiency Syndrome. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third
Edition, 2008, 571-582.
3. Kenneth Todar. Immune Defense against Bacterial Pathogens: Adaptive or Acquired Immunity. In
Todar’s Online Textbook of Bacteriology. www.textbookofbacteriology.net/adaptive. Reference Type:
Internet Communication.
4. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis
and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 906-913.
5. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. T- and B-
Lymphocyte Differential Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
7. Marie-Dominique Franco. Immunology, HIV and AIDS. http://www.biol.sc.edu/courses. Ref Type:
Internet Communication.
8. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow
Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
9. Paul A. Linnemeyer. The Immune System – An Overview, 2008. www.the body.com. Ref Type:
Internet Communication.
10. Prof. Schlissel. The Immunology of HIV Infection and AIDS. http://mcb.berkeley.edu/courses. Ref
Type: Internet Communication.
11. Robert R. Rich, Thomas A. Fleisher. William T. Shearer, Harry W. Schroeder, Anthony J. Frew,
Cornelia M. Weyand. Fundamental Principles of the Immune Response. In Clinical Immunology.
Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 3-127.
12. Shane Crotty, Rafi Ahmed. Immunological Memory. In Topley & Wilson Microbiology & Microbial
Infections, Immunology, Hodder Arnold, 10th Edition, 2005, 487-503.

IMUNOFENOTIPARE LIMFOCITARĂ – IMUNITATE TUMORALĂ

SynevoImunofenotipare limfocitară – imunitate tumorală
1035 Lei
În București, se efectuează doar cu programare la numărul 021 9666.
Informaţii generale
Transformarea neoplazică a unei celule reprezintă prima etapă din istoria naturală a cancerului. Celula
tumorală odată apărută determină, prin diviziuni succesive, formarea unei clone celulare şi în final
constituirea ţesutului tumoral, cu exprimarea principalelor caracteristici ale fenotipului malign şi anume:
proliferarea excesivă şi infinită, migrarea anormală şi instabilitatea genetică1.
La adult leziunea canceroasă reprezintă, în cele mai multe cazuri, stadiul final al unei inflamaţii cronice
(de exemplu, fumatul se asociază cu neoplasmul pulmonar, radiaţiile solare cu cancerul cutanat), pe
când la copil este rezultatul unei instabilităţi genomice progresive, înnăscută sau datorată unor leziuni
genetice dobândite. Tumorile pediatrice sunt sărace în celule ale imunităţii dobândite (celule T şi celule
dendritice mieloide)6.
Problema existenţei cu adevărat a imunovigilenţei în cazul tumorilor nu este încă rezolvată. În timp ce
în cazul bacteriilor şi a virusurilor, care exprimă o varietate de proteine străine, sistemul imun poate
recunoaşte şi controla efectiv infecţia, în cazul celulelor tumorale, care diferă foarte puţin de cele
normale, răspunsul imun nu mai are aceeaşi eficienţă2.
Antigenele tumorale
În mod ideal, pentru a fi recunoscute ca străine de către sistemul imun, ar trebui ca antigenele tumorale
să fie exprimate doar de celulele tumorale, nu şi de cele normale. În realitate majoritatea antigenelor
tumorale sunt puţin imunogene, fiind slab exprimate şi foarte heterogene. În acelaşi timp există şi
antigene supraexprimate la nivelul celulei tumorale, dar care se găsesc de asemenea în cantităţi mici în
celulele normale2.
Antigenele tumorale recunoscute de limfocitele efectoare au fost clasificate astfel:
– antigene străine organismului (specific tumorale): molecule ce sunt expresia unor gene mutante,
oncogene virale, molecule ce prezintă modificări post-translaţionale anormale (de exemplu, MUC1–
underglycosylated mucin). În cazul acestor proteine mutante, doar cateva peptide pot fi potenţial
recunoscute ca străine organismului;
– self-antigene: antigene testiculare, antigene de diferenţiere care se exprimă doar în anumite tipuri de
ţesuturi (de exemplu, antigenele de diferenţiere exprimate de melanocite şi celule melanomatoase
implicate în producerea de melanină), antigene supraexprimate de celulele tumorale comparativ cu
statusul lor normal (de exemplu, – tirozinaza exprimată în mod normal de toate melanocitele apare în
concentraţii crescute în celulele melanomatoase); celulele T cu specificitate pentru tirozinază, ce
recunosc şi distrug celulele tumorale, pot fi găsite în sângele unor pacienţi cu melanom; aceste celule T
sunt responsabile de depigmentarea pielii (vitiligo) la aceşti pacienţi, fapt ce se asociază cu un prognostic
bun; – antigenele fetale (AFP şi CEA) prezente în tumori ale ficatului, gonadelor şi în diverse
adenocarcinoame se găsesc în cantităţi crescute în timpul dezvoltării fetale, dar sunt puţin exprimate în
mod normal la adult; aceste oncogene fetale sunt folosite ca markeri de progresie tumorală; – HER-
2/neu , cunoscut ca şi c-Erb-2 (receptor tirozin-kinazic omolog cu receptorul factorului de creştere
epidermal). Răspunsul faţă de toate aceste antigene constă în celule efectoare CD4+ şi/sau CD8+1;2.
Mecanisme de evaziune a apărării imune în cancer
Formaţiunile tumorale au proprietatea de a fi tolerate de sistemul imun prin exprimarea unor factori care
influenţează negativ răspunsul imun al organismului.
Există o serie de motive pentru absenţa unui răspuns imun eficace în cazul tumorilor. Fiecare proteină
autologă este degradată în citoplasmă până la peptide formate din 9-12 aminoacizi. Aceste peptide sunt
transportate de către un sistem numit „tranporter associated with antigen processing (TAP)” la reticulul
endoplasmic unde sunt legate de moleculele MCH clasa I şi prezentate celulelor T CD8+2.
În cazul tumorilor, peptidele nu se “potrivesc” mereu la locul de legare pe moleculele MCH clasa I.
Existenţa unui mecanism defectuos de procesare a antigenelor la nivelul celulei tumorale (de exemplu,
deficitul de TAP) face ca peptidele tumorale să nu fie transportate la nivelul reticulului endoplasmic şi
să nu fie prezentate la suprafaţa celulei. În multe cazuri diminuarea moleculelor MCH clasa I şi II pe
suprafaţa celulelor tumorale împiedică recunoaşterea acestora de către limfocitele T şi astfel răspunsul
imun nu poate fi declanşat2;6.
Celulele tumorale nu pot fi considerate adevărate celule prezentatoare de antigen, deoarece le lipsesc
molecule co-stimulatoare importante, CD80 şi CD86, necesare pentru activarea celulelor T. În absenţa
co-stimulării, prezentarea peptidelor via complex MCH/TCR, duce la anergia celulelor T şi toleranţă.
Unele celule tumorale sunt de asemenea capabile de a stopa producerea de antigene tumorale evitând
astfel răspunsul imun. De asemenea tumorile pot produce substanţe imunosupresive aşa cum sunt IL-
10, TGFβ (transforming growth factor beta), prostaglandine, iar în unele cazuri celulele tumorale pot
exprima molecule MCH I-like ce interacţionează cu liganzii inhibitori aflaţi pe celulele T, ducând în
final la anergia/apoptoza celulelor T2.
Asemănător virusurilor (HIV, HCV), tumorile solide sunt caracterizate prin instabilitate genomică ceea
ce conduce la generarea unor neoepitopi identificaţi potenţial de moleculele MCH clasa I şi II3.
În ultima decadă s-a observat un interes crescut faţă de mecanismul dominant de toleranţă mediat de
celulele T reglatoare – Tregs (CD4+CD25+), ce par să joace un rol important în autoreactivitate, alergii,
infecţii şi transplant, controlând atât răspunsul imun înnăscut cât şi pe cel dobândit, limitând astfel
autoimunitatea şi imunopatologia. Selecţia acestor celule are loc în mod natural în timus – natural T
regulatory cells (nTreg), dar pot fi induse şi în periferie – induced Treg cells (iTreg). Efectul supresor
al celulelor Treg asupra răspunsului imun tumoral este bine documentat. Astfel, studiile efectuate pe
şoareci arată că îndepărtarea celulelor Treg favorizează rejetul celulelor tumorale putând chiar să prevină
dezvoltarea acestora in vivo, atât la şoarecii „predispuşi la cancer” cât şi după tratamentul cu agenţi
chimici. În studiile efectuate pe pacienţii cu cancer s-a observat prezenţa mult mai frecventă a celulelor
Treg în populaţia limfocitară periferică decât la persoanele sănătoase. Există, de asemenea rapoarte din
care reiese faptul că nivelele crescute de Treg se corelează cu un stadiu avansat al bolii, fiind implicate
astfel în progresia cancerului. Infiltrarea cu celule T reglatorii este de asemenea prezentă şi în staţiile
ganglionare metastazate, nu şi în cele fără metastaze1;3.
Mecanisme efectoare ale imunităţii
La adult, răspunsul imun înnăscut are rolul de a recunoaşte celulele “stresate” sau conţinutul celular
nedigerat atunci când celulele devin nonapoptotice sau nonautofagocitice.
Răspunsul imun adaptativ (dobândit) joacă un rol crucial, fiind o sursă bogată de celule T efectoare CD4
şi CD8 cu rol în recunoaşterea proteinelor aberante ce apar la nivelul tumorii, în acelaşi timp
reprezentând sursa unor celule regulatoare şi a unor factori cu rol important în limitarea abilităţii
celulelor NK şi a celulelor T de a media eradicarea cancerului6.
Modul în care diferitele tipuri de celule implicate în generarea răspunsului imun influenţează în sens
pozitiv sau negativ creşterea tumorală este prezentat în tabelul următor1:
Celule – Inhibarea creşterii Acţiunea supresivă a Referinţe legate de rolul
efectoare tumorale celulelor Treg asupra celulelor Treg
celulelor efectoare
– Favorizarea creşterii
tumorale
Celule T – citotoxice prin
CD8+ perforina/granzima sau
ligandul Fas/Fas;
– secreţia de IFNγ,TNFα
– supresie prin TGFβ Piccirillo şi Shevach (2001);
Somasundaram et
al. (2002);
Antony et al.
(2005) Chen et al. (2005)

Celule T – iniţiaza activarea – cele mai multe teste Itoh et al. (1999) şi multe
CD4+ celulelor CD8+; funcţionale de alte studii ulterioare
supresie utilizează
– citotoxice prin ligandul
celulele CD4+
Fas/Fas;
– ajută celulele B;
– inhibă angiogeneza;
– activează macrofagele
prin secreţia de IFNγ;
– recrutează eozinofilele
prin secreţia de IL-4

Celule γδ – citotoxice prin NKG2D; – nu a fost analizata

– activează celulele Tαβ
pentru a secreta IFNγ

Celule B – produc anticorpi – supresie directă Lim et al. (2005)

antitumorali; asupra celulelor B
fără supresia celulelor
– prezintă antigenele
Th
tumorale;
– iniţiază creşterea
tumorală cu ajutorul
factorului solubil

Celule NK – citotoxice prin – suprimă activitatea Trzonkowski et al. (2004);

granzime/perforine sau citotoxică;
Romagnani et al. (2005)
ligandul Fas/Fas;
– există o corelaţie
Ghiringhelli et al. (2005);
– exprima FcR pentru a inversă între activarea
media ADCC NK şi numărul de Smyth et al. (2006);
(citotoxicitate celulara celule Treg la
dependenţa de anticorpi) pacienţii cu Simon et al. (2007)
neoplasme
 Celule NKT – produc citokine, – suprimă secreţia de Azuma et al. (2003);
stimulează celulele NK şi citokine şi activitatea
Nishikawa et al. (2003);
celulele CD8+- actiune citotoxică a celulelor
citotoxică; NKT La Cava et al. (2006)
– inhibă celulele Th1 şi T
CD8+ prin lL-3

Celule Legătura între răspunsul – reduce expresia DiPaolo et al. (2007)

dendritice imun înnăscut şi cel CD80 şi CD86 pe
dobândit– IDO+DC celulele dendritice
(celule dendritice
secretoare de indol amin
2,3- dioxigenaza) inhibă
proliferarea celulelor T
inducand toleranţa

Macrofage – exprimă FcR ce mediază – la om, Treg suprimă Taams et al. (2005)
ADCC sau ADCP secreţia de citokine şi
(fagocitoza); mecanismul de
prezentare a
– tipul M1 este citotoxic
antigenelor de către
prin oxidul nitric;
macrofage
– tipul M2 secretă
arginază, favorizează
angiogeneza, inflamaţia
şi creşterea tumorală

Neutrofile – exprimă FcR pentru a – inhibă radicalii Lewkowicz et al. (2006)

media ADCC- citotoxice liberi de oxigen şi
prin radicali liberi de producerea de
oxigen, proteaze etc.; citokine;
– secreţia de citokine – induc moartea
proinflamatorii cum sunt neutrofilelor
IL1β, TNFα şi INF

Eozinofile – acţiune tumoricidă – influenţează negativ Kearley et al. (2005)

directă; funcţiile şi recrutarea
eozinofilelor (posibil
– un număr crescut de
prin celulele Th2)
eozinofile se asociază cu
un prognostic bun

Imunofenotipare limfocitară – profil tumoral şi recomandări pentru efectuarea acestui test

În cadrul profilului tumoral sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută următoarele
subseturi de limfocite, prin identificarea markerilor de suprafaţă specifici (moleculele CD):
 limfocitele T totale (CD3+);
 celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
 celule CD31+ (rezerva timică);
 limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
 celule Treg (CD25++/CD127-);
 celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice), celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
 raport CD4+/CD8+;
 celule T imature (CD4+/CD8+);
 celule T activate ( CD3+/HLA DR+);
 celule B (CD19+)
 celule NK (CD16+/CD56+) şi NK activate.
Testul este indicat pentru monitorizarea statusului imun la pacienţi cu diverse afecţiuni maligne, mai
ales dacă sunt aplicate tratamente de imunostimulare4.
În cursul evoluţiei neoplaziilor, se instalează constant un status de imunodeficienţă (ce trebuie urmărit
în dinamică) de intensitate diferită în funcţie de tipul tumorii, stadiul procesului malign şi mijloacele de
apărare ale organismului9.
Celulele T naive CD4+CD31+ reprezintă o subpopulaţie a celulelor T CD4+ naive recent eliberate din
timus.
Statusul „CD28” diferenţiază limfocitele CD8 cu proprietăţi citotoxice. Numărul celulelor T citotoxice
nu dă informaţii despre funcţia lor, acest lucru fiind posibil prin teste funcţionale (teste de
citotoxicitate)4.
Celulele T CD8+ pot fi împărţite în funcţie de expresia pe suprafaţa lor a receptorului co-stimulator
CD28 în CD28+ (aproximativ 50% din celulele CD8+) şi CD28-, fiecare din cele două populaţii
limfocitare având proprietăţi biologice şi secretoare diferite.
Populaţia de celule T CD28+ predomină la indivizii sănătoşi şi proliferează în timpul infecţiilor virale
primare.
S-a observat că celulele T reglatorii CD8+ CD28- sunt prezente aproape constant în infiltratul
limfocitar tumoral, fiind un potent factor supresor faţă de răspunsul imun, putând inhiba, prin
intermediul IL 10, atât proliferarea celulelor T cât şi citotoxicitatea specifică anti-tumorală3;8.
Celulele T CD8+ CD28- sunt prezente în procent mai mare în sângele periferic al bolnavilor de cancer
decât la voluntarii sănătoşi.
Superfamilia CD28 este formată din molecule receptoare cu acţiune co-stimulatoare (CD28 şi
costimulatorul inductibil – ICOS) sau inhibitoare (CTLA-4, PD-1 şi BTLA) asupra celulelor T. CD28
şi CTLA-4 sunt receptori specifici ai celulelor T pe când BTLA şi PD-1 sunt exprimate şi pe celulele B,
iar ICOS pe celulele NK. Activarea sau inhibarea celulelor T ca răspuns la un stimul antigenic necesită
două semnale din partea celulelor prezentatoare de antigen (APC). Primul semnal este reprezentat de
antigenul exprimat de APC sub forma peptidelor legate de moleculele MCH, care se leagă de TCR.
Recunoaşterea antigenului de către receptorii celulei T asigură specificitatea răspunsului. Al doilea
semnal, co-stimulator sau inhibitor, este asigurat de interacţiunea unor anumiţi receptori ai celulelor T
cu liganzii corespunzători de la suprafaţa APC. CD28 este considerat prototipul receptorului co-
stimulator. Se consideră că CD28 este prezent pe aproape toate celulele T CD4+ şi doar pe jumătate din
celulele CD8+. În absenţa co-stimulării semnalele venite de la TCR pot induce anergia celulelor T. În
prezenţa celor două semnale are loc producerea de citokine (de ex. IL2) ca şi poliferarea, diferenţierea
şi supravieţuirea celulelor T.
De menţionat este faptul că atât CD28 cât şi CTLA-4 se leagă de aceeaşi liganzi (CD80 şi CD86) pe
suprafaţa APC. CTLA-4 inhibă producţia de IL2 şi proliferarea celulelor T, fiind implicat în inducţia şi
menţinerea toleranţei7.
Specimen recoltat – sânge venos4.
Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant4.
Volum proba – 5 mL sânge4.
Stabilitate proba – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul
şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei4.
Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau
congelate4.
Metoda – citometrie in flux4.
 Valori de referinţă, comunicarea şi interpretarea rezultatelor
Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei
pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute4.
Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de factori
biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile circadiane
au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp ce limfocitele
CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în cursul după-amiezei.
Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populaţiilor limfocitare se recomandă
ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al zilei5.
Orientativ, prezentăm câteva modele patologice de imunofenotipare asociate unor afecţiuni maligne:
 epiteliom al buzei (operabil): scăderea valorilor procentuale pentru celulele T totale (CD3+), T activate
( CD3+/HLA DR+) şi NK ( CD16+/CD56+);
 adenocârcinom de col uterin (stadiul I – II): scăderea proporţiei de celule T CD8+ (probabil T citolitice)
şi, inconstant, scăderea celulelor NK (CD16+/CD56+);
 adenocârcinom mamar (stadiul II): limfopenie, scăderea celulelor T totale (CD3+), B totale (CD19+),
scăderea raportului CD4+/CD8+, creşterea celulelor T CD8+ (probabil T supresoare);
 adenocârcinom pulmonar (operabil): limfopenie, scăderea celulelor T totale (CD3+), T
activate (CD3+/HLA DR+), inconstant scăderea celulelor B (CD19+)9.
Creşterea celulelor T reglatoare în cursul terapiei imunostimulatoare este nefavorabilă,
datorită proprietăţilor imunosupresoare ale acestora4.

Bibliografie
1. AM Gallimore and AK Simon. Positive and negative influences of regulatory T cells on tumor
immunity. In Oncogene (2008) 27, 5886-5893.
2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto. Tumor Immunology. In Color Atlas of Immunology.
Thieme 2003, 150-154.
3. Gilberto Filaci et al. CD8+CD28-T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and
cytotoxic function infiltrate human cancers. In The Journal of Immunology,2007,179,4323 – 4334
4. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
5. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow
Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
6. Michael T Lotze, Markus Y Mapara, Carl H June. Tumor immunology and immunotherapy. In
Clinical Immunology. Principles and Practice, , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1181-1199.
7. Raul M. Torres, John Imboden, Harry W. Schroeder Jr. Antigen receptor genes, gene products, and
co-receptors. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008,
74-75.
8. Simona Fiorentini et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+T lzmphocytes with phenotype and
function of both naïve/memory and effector cells. The Journal of Immunology,2001,166, 900 – 907.
9. Voiculescu C. et al. Aplicaţiile imunofenotipării prin citometrie în flux în imunodiagnosticul şi
monitorizarea unor afecţiuni umane. În Citometria de flux în medicina clinică şi experimentală, Ed.
Acad. Rom., Buc., 1996, 109-113.
Celulele B autoreactive sunt centrale în patogeneza bolilor autoimune (AID), nu numai prin
producerea de autoanticorpi, ci și prin secreția de citokine și prin prezentarea autoantigenilor.
Schimbările în metilarea ADN-ului, modificările histonei și expresia miRNA, semne distinctive ale
insuficienței epigenetice, caracterizează celulele B izolate de la pacienții cu AID, evidențiind
contribuția proceselor epigenetice la autoreactivitate. Dovezi suplimentare privind implicarea
epigenetică în dezvoltarea autoreactivității celulelor B provin din studiile in vivo și in vitro care
utilizează agenți de demetilare ADN ca factori de accelerare sau inhibitori de deacetilază ai histonei
ca factori de reprimare. Ca urmare, o mai bună înțelegere a proceselor epigenetice modificate în AID
și în special în celulele B deschide perspective pentru dezvoltarea de noi terapii.