PURIFICAREA CELULELOR ŞI A PĂRŢILOR COMPONENTE

Studiile referitoare la componentele celulare necesită izolarea celulelor din contextul lor
tisular, precum şi separarea componentelor subcelulare după criterii bine stabilite. De
exemplu, elementele figurate ale sângelui (hematii, leucocite) posedă densităţi diferite
datorită faptului că eritrocitele sunt anucleate; separarea acestor două tipuri celulare se
face foarte simplu prin centrifugare de densitate la echilibru.
Studiul anatomiei celulare şi mai ales a componentelor subcelulare alături de studiul
biochimic al celulei presupune desfacerea celulelor în elementele componente urmată de
separarea sau caracterizarea acestora

CITOMETRIA DE FLUX (flow cytometry)

Reprezintă o metodă de separare şi caracterizare a populaţiilor celulare dintr-o suspensie
pe baza proprietăţilor optice (dispersia luminii sau fluorescenţa indusă). Este un
instrument de lucru adresat în special tehnicilor imunologice care presupun separarea
unor subseturi celulare derivate mai ales din sânge. Citometria de flux mai este denumită
şi sortare celulară activată prin fluorescenţă (FACS – fluorescence activated cell
sorting). Ca şi aplicaţii clinice subliniem implicarea acestei metode în clasificarea
leucemiilor sau limfoamelor precum şi în prognosticul infectării HIV.
Un flow-citometru poate identifica diferitele tipuri de celule prin măsurarea cantităţii de
lumină dispersată sau a cantităţii de fluorescenţă emisă, în timpul în care aceste celule în
soluţie traversează un spaţiu iradiat cu un fascicul laser. Astfel, dintr-un amestec celular
se pot separa celule cu caracteristici asemănătoare (fig. 5-34 Lodish)

FRACŢIONAREA CELULARĂ
Definiţie
Este o tehnică bazată pe caracteristicile structurilor subcelulare (formă, dimensiune,
densitate) care reuşeşte să le diferenţieze astfel permiţând separarea lor. Celulele pot fi
dezmembrate prin:
- şoc osmotic
- ultrasonicare
- filtrare prin site mici
Dacă celula este dezmembrată într-o manieră delicată, fiecare din organitele sale poate fi
izolat. Procesul de dezmembrare celulară se numeşte omogenizare iar procesul ulterior
de izolare a organitelor se numeşte fracţionare. Izolarea organitelor necesită tehnici de
chimie fizică mergând de la strecurare prin site simple, la sedimentarea gravitaţională sau
precipitare diferenţială sau la ultracentrifugare sau marcare fluorescentă a fragmentelor în
gradiente de densitate generate pe computer.

Scop
Izolarea componentelor celulare sau subcelulare, a complexelor macromoleculare acizilor
nucleici sau enzimelor în scopul definirii rolului lor individual în celule.
Individualizarea componentelor celulare permite menţinerea lor într-o stare de
funcţionare, în condiţii prestabilite, fără a necesita prezenţa unei celule sau a unui grup de
celule. Aceste sisteme de studiu, acelulare, sunt utilizate în toate sistemele experimentale
de investigare a rolului organitelor celulare.

Omogenizarea
Primul pas în vederea fracţionării este izolarea celulelor şi obţinerea unui eşantion „pur”.
Celulele izolate (cele din sânge sau din culturi de celule) pot fi separate pe baza formei
sau a unor markeri de suprafaţă (încărcare electrică, antigene sau enzime de suprafaţă).
Celulele din context tisular trebuie separate de celulele vecine, eliberate din joncţiuni prin
activitate mecanică sau enzimatică. Dezagregarea joncţiunilor de tip desmosomal sau
joncţiunilor strânse se poate realiza cu chelatori (eliminatori) de Ca, Mg alături de forţe
mecanice. Tehnicile de omogenizare cuprind:
- tehnici bazate pe alterarea osmotică a mediului în care sunt celulele
- tehnici bazate pe forţe mecanice – mojarare, blender, compresiune/expansiune,
ultrasonicare
Aceste tehnici determină ruperea majorităţii membranelor celulare cu formarea ulterioară
de microvezicule închise. Dacă tehnica este bine executată, organite ca mitocondriile,
nucleul, complexul Golgi sau lizozomii rămân intacte. Disrupţia reticolului
endoplasmatic rugos determină formarea unor microvezicule cu conţinut variabil, numite
microsomi. Suspensia celulară este redusă la un omogenat (sau extract) care conţine
diferite compartimente veziculare cu conţinut variabil, încărcare şi densitate diferite.

Fracţionarea
Reprezintă tehnica de separare a elementelor dintr-un omogenat.
După omogenizarea celulelor, diferitele componente pot fi separate. Pentru unele
materiale (sânge integral, celule în suspensie) aceasta se poate realiza prin sedimentare
gravitaţională. În această tehnică, separarea are loc prin diferenţele naturale de formă şi
dimensiune (densitate) dintre celule. Hematiile sunt mai dense decât leucocitele, astfel
încât separarea determină depunerea unui strat de hematii la fundul eprubetei de
sedimentare, urmat superior de un strat de leucocite
Centrifugarea reprezintă cea mai folosită tehnică de fracţionare a componentelor celulare
utilizând forţa centrifugă. Tehnicile care folosesc recipiente de centrifugare de volum mai
mare şi incinte frigorifice sunt tehnici preparative; tehnicile care folosesc viteze de
centrifugare mari în recipiente mici sunt tehnici analitice. O centrifugă de peste
20.000RPM este o ultracentrifugă. Organitele pot fi separate într-o centrifugă prin variate
metode. Particulele se comportă diferit sub acţiunea forţei centrifuge: particulele în
suspensie pot fi separate fie prin sedimentare de viteză fie prin sedimentare de echilibru.
Sedimentarea de viteză se mai numeşte şi centrifugare zonală şi are avantajul unei
centrifugări la viteză redusă pentru o perioadă scurtă de timp dar conferă separări
incomplete. Sedimentarea de echilibru se mai numeşte izopicnică sau de echilibru la
densitate şi necesită viteze mari de centrifugare pentru perioade mai lungi de timp, având
avantajul unei separări complete.
Sedimentarea gravitaţională
Reprezintă o metodă de separare grosieră a componentelor unui omogenat. Separarea are
loc în funcţie de criteriile dimensiune şi densitate. Componentele mai mari se mişcă cel
mai repede sub acţiunea forţei centrifuge şi se vor depune primele la nivelul fundului
eprubetei de centrifugare. La viteze relativ mici, componentele mari ca nucleii sau
fragmentele celulare formează un depozit (pelet). O viteză superioară de centrifugare
determină formarea unui pelet din mitocondrii. Ultimele componente care sedimentează
la viteze foarte mari sunt elementele reticulului endoplasmatic şi ribozomii. Peletul poate
fi extras după fiecare treaptă de centrifugare. Deoarece separarea nu este de mare fineţe,
peletul extras poate fi resuspendat şi recentrifugat de câteva ori pentru a obţine un eşantin
pur

Sedimentarea de viteză
Este o metodă de rafinare a sedimentării gravitaţionale. Se bazează pe criteriile
dimensiune şi formă a particulelor de separat. Particulele din soluţia centrifugată sunt
accelerate şi ating o viteză finală; această viteză finală este determinată în parte de
dimensiuni, greutate, densitate şi forma particulelor ca şi de viscozitatea mediului în care
se desfăşoară procedura şi de forţa centrifugă generată. Viteza finală este denumită viteza
de sedimentare a particulei şi poate fi utilizată pentru măsurarea dimensiunii, greutăţii sau
densităţii particulei.
Practic, separarea are loc prin centrifugarea unui omogenat dispus ca un strat la suprafaţa
unei soluţii saline din tubul de centrifugare. Deoarece un preparat mai dens (omogenatul)
are tendinţa de a se amesteca în soluţia de sedimentare, această soluţie este amplasată
într-o soluţie de sucroză care este astfel preparată încât concentraţia acesteia descreşte de
la fundul spre gâtul tubului de centrifugare. Se creează un gradient de densitate care
rafinează sedimentarea de viteză şi permite separarea diferitelor componente ale
omogenatului sub formă de benzi. Aceste benzi se menţin datorită gradientului de
densitate. Din aceste benzi de sedimentare se pot extrage individual componentele
celulare. Rata de sedimentare (poziţia finală a fiecărui component) depinde de forma şi
dimensiunile particulelor şi este caracterizată de un coeficient de sedimentare (s).
Centrifugele moderne care ating viteze de rotaţie de 80.000 rpm (rotaţii pe minut)
dezvoltă forţe de 500.000G, forţe care pot determina separarea unor molecule minuscule,
cum ar fi ARNt sau enzimele.

Addenda
Coeficientul de difuziune
Când o particulă atinge viteza finală, este afectată de difuziune, de obicei în direcţia
opusă deplasării sale determinată de forţa centrifugă. Este o mişcare de tip brownian şi
poate fi statutată matematic ca o constantă – coeficientul de difuziune – reprezentând
gradul de împrăştiere a moleculei în timp. Este exprimat în unităţi Fick. 1 Fick = 10 -7
cm2/sec. Există o relaţie directă între coeficientul de difuziune a unei particule şi
diametrul său. Ambele sunt raportate la coeficientul de sedimentare al particulei.
Coeficientul de sedimentare este determinat de formula
S = 1/2r x dr/dt unde
-  este viteza angulară a rotorului exprimată în radiani/sec şi este egală cu 0,10472 x
RPM
- r = distanţa dintre particulă şi centru de rotaţie (mm)
- dr/dt = rata deplasării particulelor (cm/sec)
Valoarea coeficientului de sedimentare pentru o particulă poate fi determinat prin
măsurarea timpului de deplasare (viteză şi distanţă) a unei particule într-un mediu de
viscozitate cunoscută. Cel mai simplu este să calculăm distanţa de deplasare a
particulelor pentru o centrifugă cu o forţă cunoscută.

Sedimentarea la echilibru
Este o tehnică de separare a componentelor dintr-un omogenat pe baza densităţii de
flotare. În acest caz, nu mai contează parametrii dimensiune şi formă.
Dacă o probă conţine mai multe particule diferite, cu diferite densităţi şi dimensiuni, ele
vor fi separate pe baza acestor parametri. Particulele mai mari vor ajunge la baza tubului
de centrifugare mai repede decât cele mai mici. Dacă forţa centrifugă este crescută
progresiv, timpul de separare poate scădea.
Gradientul de concentraţie din tubul de centrifugare (gradient de sucroză sau clorură de
cesiu) este mult mai accentuat decât pentru sedimentarea de viteză. Prin centrifugare,
componentele celulare se deplasează spre fundul tubului de centrifugare şi se opresc şi
flotează în momentul în care ajung într-un strat unde densitatea este echivalentă cu
densitatea proprie. La finalul centrifugării se formează benzi din care cea mai apropiată
de fundul centrifugii este compusă din elemente cu densitatea de flotare cea mai mare.
Metoda este utilă pentru separarea unor componente asemănătoare care incorporează sau
nu (experimental) izotopi grei.