– Lucrare de laborator –

FABRICAREA DE MICROSTRUCTURI DE HIDROGEL PE BAZA DE PEG

PRIN FOTOLITOGRAFIERE-UV

Fotopolimerizarea reprezinta o metoda atractiva de a incapsula diferite tipuri de celule

in hidrogeluri datorita conditiilor de reactie biocompatibile ce nu afecteaza metabolismul
celular: fotoinitiatori citocompatibili si intr-o concentratie mica, lipsa solvent toxic,
intensitate scazuta a radiatiei UV (≤6mW/cm2 la 365 nm), intensitate scazuta a radiatiei VIS
(≤80mW/cm2 la 470-490 nm) care nu afecteaza viabilitatea celulara (fibroblaste, condrocite,
insule Langerhans pentru obtinerea de pancreas artificial etc.). Hidrogelurile obtinute prin
fotopolimerizare pot fi folosite si ca sisteme de eliberare controlata pentru principii biologic
active (medicamente, factori de crestere, enzime).

Prima etapa in reactia de fotopolimerizare este fotoinitierea, care necesita prezenta

unui initiator adecvat ce absoarbe radiatia luminoasa la o anumita lungime de unda in
domeniul ultraviolet (200-400 nm) sau vizibil (400-800 nm).

Fotolitografierea (litografia optica) reprezinta tehnica de expunere a unui strat de

fotorezist depus pe un substrat la o radiatie luminoasa de o anumita lungime de unda, prin
intermediul unei măşti. Aceasta este metoda principala de obtinere a circuitelor integrate
pentru realizarea de dispozitive electronice.

1
 Substantele fotosensibile (fotorezist) se expun radiatiei cu
scopul transferului imaginii/desenului de pe masca (sablon) pe
substrat. Astfel radiatia luminoasa activeaza numai anumite zone din
fotorezist, lasand intacte celelalte zone.
Procedeul de fotolitografiere poate fi folosit pentru fabricarea
de hidrogeluri (structuri 3D) pe baza de polimeri sintetici
(polietilenglicol - PEG) sau naturali (gelatina, alginat, acid
hialuronic) functionalizati cu grupari adecvate (met-acrilat) pentru a
permite reactia de fotopolimerizare.
De asemenea, aceasta tehnica poate fi folosita si pentru
modificarea texturii unor suprafete in vederea imbunatatirii
interactiunii interfaciale biomaterial/celule. Astfel, o anumita
structurare a suprafetei aplicata uniform prin crearea de “pattern-uri”
de ordinul µm sau nm poate imbunatati/stimula aderenta celulara.
Polietilenglicolii (PEG) reprezinta polimeri ai etilenglicolului care au ca unitate repetitiva
HO–(CH2CH2O–) n H n = 3÷200

Tipurile de PEG sunt desemnate in practica prin cifra ce indica masa moleculara M,
consistenta PEG variind cu gradul de polimerizare n (M intre: 20 - 100 = lichid; 100 - 1000 =
semisolid; 1000 - 6000 = solid). In structura chimica a PEG se regasesc doua grupari OH
marginale ce confera acestor polimeri un caracter puternic hidrofil (usor miscibili cu apa).
Gruparile OH pot fi convertite prin diverse reactii chimice in alte grupari functionale cum ar
fi de ex. carboxil, amino, (met)acrilat etc.
Datorita solubilitatii lor in apa si biocompatibilitatii crescute, acesti polimeri sunt folositi
frecvent in diverse aplicatii biomedicale cum ar fi:
1. obtinerea de compusi conjugati PEG-proteine pentru
aplicatii farmaceutice;

2
2. tratarea cu PEG a dispozitivelor medicale pentru a reduce
adsorbtia proteinelor si adeziunea celulara (suprafete non-
aderente “protein repellent surfaces” pentru obtinerea de
materiale hemocompatibile);

3. sinteza de hidrogeluri pe baza de PEG pentru incapsulare

de celule
Hidrogelurile pe baza de PEG au fost studiate
intens ca biomateriale pentru ingineria tisulara datorita
comportamentului similar cu cel al tesuturilor moi, la gonflare
in apa generand o retea tridimensionala care permite accesul
prin difuzie al nutrientilor catre celule.
Dezavantajele acestor tipuri de hidrogel sunt reprezentate in principal de absenta
activitatii biologice din cauza incapacitatii PEG de a adera la celule si respectiv de faptul ca
nu sunt biodegradabile. Ambele inconveniente pot fi eliminate prin procese adecvate de
modificare chimica. Astfel, biofunctionalizarea hidrogelurilor de PEG cu molecule biologic
active (peptide de aderenta celulara – RGD: Arg-Gly-Asp; factori de crestere - GF etc.), care
simuleaza componentele prezente in mod natural in matricea extracelulara (ECM), creste
aderenta celulara la aceste hidrogeluri. De asemenea, biodegradabilitatea hidrogelurilor de
PEG poate fi imbunatatita prin incorporarea de segmente degradabile (poliesteri, punţi
disulfidice etc.)
Cea mai frecventa abordare folosita pentru a sintetiza
hidrogeluri pe baza de PEG, insolubile in apa, este
fotopolimerizarea derivatilor de PEG care contin grupari
(met)acrilat: PEG diacrilat (PEG-DA) sau PEG dimetacrilat
(PEG-DMA).

Partea experimentala
Scopul acestei lucrari este simularea procesului de fotolitografiere si obtinerea prin
fotopolimerizare a unei retele polimerice pe baza de PEG-DMA cu potentiale aplicatii in
ingineria tisulara si/ sau eliberare controlata de substante bioactive.

3
 Reactia de fotopolimerizare a PEG-DMA

Necesar materiale
Polietilen glicol dimetacrilat (PEG-DMA) M = 550; n =10
2,2-Dimethoxy-2-fenil-acetofenonă (DMPA) (fotoinitiator: Irgacure 651)
N-Vinil pirolidonă (NVP) pentru solubilizarea DMPA
-tub Falcon, tub Eppendorf, sisteme de agitare ciclonica, spatule, pipete, penseta; Lampa UV
365 nm; folii transparente; placi de sticla.

Mod de lucru:
1. Prepararea solutiei de initiator (DMPA) în solvent reactiv NVP
Se calculeaza cantitatea de DMPA necesara pentru a obtine 0.5 ml soluţie de
concentratie 300mg/ml initiator DMPA in NVP.
Se cantareste cantitatea calculata de initiator DMPA si se solubilizeaza in NVP.
Solubilizarea se va realiza la temperatura camerei utilizand vortex-ul (prin agitare ciclonica)
pentru un interval de timp de minim 2 min.

2. Prepararea amestecului de reactie PEG-DMA/ initiator DMAP

Intr-un tub falcon se prepara o solutie-stoc formata din 10 ml PEG-DMA si 20μl/ml
sol. DMPA/NVP. Amestecul se mentine sub agitare ciclonica la temperatura camerei, timp de
aprox. 10 min si se lasa sa se “odihneasca” pana solutia redevine transparenta.
In aceasta etapa, in solutia de precursor
astfel preparata se pot adauga diversi compusi
(ex. celule) pentru a obtine sisteme multi-
component cu proprietati specifice.

4
3. Pregatirea matritei si a sabloanelor de fotopolimerizare
Pe o placa de sticla se plaseaza o matrita de silicon (PDMS) cu dimensiunile de 6.5
mm x 4 mm si grosime de 1 mm.
Obs: Pentru ca matrita de silicon sa se prinda de placa de sticla fara ca solutia de polimer sa
curga, atat placa de sticla cat si matrita trebuie curatate foarte bine in prealabil. Matrita de
silicon se fixeaza pe placa de sticla imediat dupa spalare si se plaseaza in etuva la 100oC
pana cand aceastea se usuca si raman fixate (aprox- 20min).
Sabloanele de fotopolimerizare sunt reprezentate de o folie transparenta special
proiectata si printata cu un anumit model (zone opace si zone transparente) ce va juca rol de
fotomasca. Se intentioneaza obtinerea a trei tipuri de materiale: membrana polimerica (cu
folie transparenta simpla) si 3 tipuri de “sabloane”.
Hidrogelul PEG-DMA se comporta asemenea unui fotorezist negativ: zonele expuse
la radiatie fotopolimerizeaza si devin insolubile in apa, in timp ce zonele neexpuse se vor
dizolva in apa (solvent pentru monomer).

4. Obtinerea de hidrogeluri pe baza de PEG prin fotopolimerizare

In matrita pregatita in etapa anterioara se pipeteaza 2 ml solutie amestec de reactie
PEG-DMA cu initiator. Solutia turnata se acopera cu folia transparenta / fotomasca.
Ansamblul astfel pregatit se plaseaza sub lampa de fotopolimerizare si se expune la radiatia
UV 365 nm timp de 1 min, conform schemei de mai jos:

La finalul procesului de fotopolimerizare, ansamblul se demonteaza si se indeparteaza

cu grija materialul obtinut si se spala cu apa distilata in vederea îndepărtarii PEG
nepolimerizat.

Video: https://www.youtube.com/watch?v=gVsWGC7azaM&feature=youtu.be