2/15/2010

REACIILE IMUNOLOGICE. REACIILE AG-AC in vitro

Studiul i aprecierea imunitii poate fi efectuat prin intermediul diferitor teste realizate in vitro sau in vivo (reacii imunologice). Pentru aprecierea rspunsului imun umoral se studiaz interaciunea dintre Ag i Ac, iar pentru aprecierea imunitii celulare se determin numrul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evalueaz citokinele, etc.

REACIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACIILE SEROLOGICE) Reacia Ag-Ac este determinat de interaciunea specific dintre epitopii Antigenului i paratopii Anticorpilor. n acest proces intervin patru tipuri de legturi: legturi de hidrogen, legturi electrostatice, forele Van der Waals i legturi hidrofobe. Legtura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermic, specific i reversibil.

Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizeaz intensitatea forelor de legtur a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea steric dintre paratop i epitop.

Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezint rapiditatea apariiei manifestrii reaciei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valena Ac, de numrul de epitopi, de temperatur, de pH, de fora ionic a mediului. Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit specific. Astfel, dac este cunoscut unul din elementele reaciei - Ag sau Ac, poate fi identificat cellalt

Reaciile Ac-Ac (reaciile serologice) au dou direcii de aplicare practic: I. Seroidentificare: Detectarea i dozarea Ag (element necunoscut - tulpini microbiene izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac specifici cunoscui. Pot fi utilizate dou surse de Ac: Ac monoclonali, absolut omogeni, dar care recunosc doar un singur epitop i Ac policlonali, ce se conin n seruri imune (antiseruri), care permit legturi de aviditate nalt cu Ag.

2/15/2010

Serurile imune se obin prin injectarea la un animal de laborator a antigenelor cunoscute. Dup o perioad de timp, serul animalului va conine anticorpi contra acestor antigene. Dar natura exact a Ac din acest ser nu poate fi cunoscut cu exactitate (Ac policlonali). Specificitatea serului trebuie s fie permanent controlat i Ac nedorii trebuie s fie eliminai prin adsorbie.

II. Serodiagnostic: Detectarea i titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) fa de un Ag specific cunoscut (coninut n diagnosticuri). Unele reacii Ag-Ac se manifest direct i pot fi observate de experimentator: de exemplu precipitarea sau aglutinarea complexelor Ag-Ac, liza unor celule purttoare de Ag pe membrana lor (hemoliz, bacterioliz, etc).

Alte reacii Ag-Ac nu se vizualizeaz spontan in vitro. n acest caz se va recurge la nite artificii experimentale, cum ar fi utilizarea Ac marcai: Ac marcai cu un fluorocrom: imunofluorescena. Ac marcai cu un izotop radioactiv: analiza radio-imun. Ac marcai cu o enzim: analiza imunoenzimatic.

INTERACIUNEA ANTIGEN-ANTICORP I. Faza specific: are loc interaciunea dintre Ag i Ac specific corespunztor. Este un fenomen rapid, invizibil, comun pentru toate reaciile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 C, n prezena unui electrolit (sol. fiziologic). II. Faza nespecific, vizibil a uniunii Ag-Ac, se manifest prin precipitare, aglutinare, liz, etc - fenomene determinate de anumite condiii (valena Ac, dimensiunile Ag, etc).

REACIA DE AGLUTINARE Din latin agglutinatio - ncleiere Reacia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci cnd determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt complei (cel puin bivaleni). Aglutinarea este determinat de formarea unei reele ntre Ag i Ac, ce permite apropierea unui numr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi poteniali aglutineaz mai activ dect Ac IgG.

2/15/2010

Clasificarea reaciilor de aglutinare 1. Aglutinare activ sau direct, n care particula figurat (Ag corpuscular) este el nsui purttor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii) 2. Aglutinare pasiv sau indirect, n care particula servete doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.

Reactii de aglutinare activa (directa) Aspect calitativ Reactia poate fi efectuata pe lama de sticla sau in tuburi. Reactia pe lama Se amesteca o picatura de ser si o picatura de suspensie bacteriana (Ag). Lectura se face la microscop sau cu ochiul liber. In caz de reactie pozitiva apar conglomerate, iar lichidul se clarifica; in caz de reactie negativa, lichidul ramane tulbure.

Reactia in tuburi In eprubeta se amesteca serul si Ag figurate (hematii, bacterii). Reactia pozitiva se manifesta prin formarea unui sediment cu aspect de umbrela inversata la fundul tuburilor (peste 20-24 ore) i clarificarea lichidului. Aprecierea intensitaii reaciei se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++). Celulele neaglutinate se sedimenteaza la fundul tuburilor sub forma de buton sau inel (reactie negativa). Lectura se face cu ochiul liber sau folosind oglinda concava a microscopului.

2/15/2010

Aspect cantitativ Metoda dilutiilor succesive Initial se efectueaza dilutii succesive ale serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) in care se introduc ulterior cantitati egale de Ag. Termostat 2 ore, apoi la t camerei 18-20 ore. Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 + (+++) se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant). Aglutinarea directa este utilizata pentru determinarea grupelor sangvine sau in diagnosticul unor maladii infectioase (seroidentificarea Ag sau depistarea i titrarea Ac din serul bolnavilor) .

Reactile de aglutinare pasiva (indirecta) Aglutinarea pasiva consta in fixarea unui Ag solubil (sau al unui Ac) pe un suport corpuscular inert, care nu intervine in reactia Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex, cristale de colesterol. Suspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este pusa in contact cu serul imun (respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. Avantajele reactiilor indirecte: facilitatea lecturii si sensibilitatea inalta.

Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) RHAI / RHAP Unele antigene de origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol). RHAI se efectueaz in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor).

n reacia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixai pe particule de latex. Reacia se efectueaz pe lama de sticl.

2/15/2010

Reacia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapid a mi/o sau Ag lor n prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecii.

Reacia de Co-aglutinare. La baza acestei reacii se afl proprietatea unei bacterii Staphylococcus aureus (tulpina Cowan) - ce are n componena peretelui celular proteina A - s fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacia se efectueaz pe lam.

REACIA COOMBS Unii Ac (monovaleni) nu sunt aglutinani n condiii normale, fiind monovalenti (ex.: anticorpii anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno-fetal n sistemul Rh). Ei pot fi depistai graie testelor Coombs. Sunt posibile 2 tehnici, n funcie de prelevat: snge de la nou-nscut sau de la femeia gravid.

- Tehnica Coombs direct. La un nou-nscut se caut prezena Ac materni anti-Rh fixai pe hematii, dac mama este Rh-. La aceste hematii suspecte se adaug un ser anti-Ig uman. Acest ser nu aglutineaz hematiile normale, din contra, el provoac aglutinarea hematiilor pe care sunt fixai Ac anti-Rh.

2/15/2010

- Tehnica Coombs indirect. La o femeie gravid RhAc anti-Rh sunt prezeni n ser. Iniial la acest ser se agaug hematii Rh+ (pentru formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplic serul anti -Ig.

REACTIILE DE PRECIPITARE Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.

Condiiile de formare a reelei de precipitare: Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate) Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalen, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator. n exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz. Utilizare: n medicina legala (determinarea apartenenei de specie a diferitor proteine: snge, sperm, etc), n igiena alimentar (depistarea falsificrii alimentelor), n diagnosticul maladiilor infectioase, etc

PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID Reactia de precipitare inelara Intr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce serul imun; pipeta se inclina si pe peretii ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Ac din ser corespund cu Ag, in zona de separare a celor doua lichide se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea complexului Ag-Ac. Avantajul metodei rapiditatea si simplicitatea. Utilizarea practica: identificarea petelor de sange, depistarea falsificarilor produselor alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli).

2/15/2010

Reacia de floculare (tehnica Ramon) Se efectueaz diluia succesiv a serului imun (Ac) la care se adauga cantiti egale de Ag. Se ntroduc probele n termostat i periodic se examineaz pentru depistarea tubului n care apare precipitatul iniial (zona de echivalen). Utilizare: pentru determinarea cantitii de toxin, antitoxin sau anatoxin.

PRECIPITAREA N MEDIU SOLID (N GEL) n aceste reacii Ag i Ac difuzeaz unul spre altul prin geloz i n zona de concentraie optim a acestor dou reactive se produce precipitarea sub form de linii albe-cenuii. Dac exist mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat n analiza calitativ a unui amestec de Ag ntr-o soluie.

Imunodifuzia simpl radial (tehnica Mancini) Se efectueaz pe o plac acoperit cu geloz, n care sunt ncorporai Ac specifici. Ag este depus n godeurile din stratul de geloz. Ag difuzeaz radial n geloz pe parcursul a 48 ore. Dac Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafaa proporional concentraiei Ag din godeu. Se utilizez pentru depistarea i cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc.

Imunodifuzie dubl (tehnicile Ouchterlony i Elek) Se acoper cu geloz o plac de sticl sau se toarn geloza n cutia Petri. n tehnica Ouchterlony Ag i Ac difuzeaz din godeurile situate la o distan de 15 mm unul de altul. n tehnica Elek cele 2 reactive difuzeaz din benzile de hrtie plasate pe suprafaa gelozei. Moleculele difuzeaz n gel n funcie de greutatea lor i formeaz linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund n zona lor de echivalen. Dac dou Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dac sunt diferite se intersecteaz. Utilizarea determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

2/15/2010

Contraimunoelectroforeza (CIEF) Este util la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute. Geloza este turnat pe o plac de sticl, Ag i Ac sunt dispui n rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distan de 10 mm. n timpul electroforezei Ag, ncrcat negativ, migreaz spre polul pozitiv, ntlnind Ac care migreaz spre catod. La interaciunea Ag i Ac omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF servete la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urin, lichid pleural, ascit, etc.

REACII DE CITOLIZ IMUN (cu participarea complementului) Activarea fraciilor complementului (C) duce la liza particulei purttoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...) Activarea complementului - Calea clasic - Calea alternativ - Calea lectinic

2/15/2010

Activarea C pe cale clasic Activatorul l constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM) Consecutivitatea activrii C: Ag-Ac fixeaz fracia C1qrs, care capt ulterior activitate esterazic (n prezena obligatorie a Ca++)

C1 activeaz C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertaz ce acioneaz asupra C3

Urmeaz clivarea C3 n C3a (anafilotoxin) i C3b, care se unete de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), formnd C5-convertaza, care cliveaz C5 n C5a i C5b

C5b se leag de membrana celulei-int. Urmeaz fixarea simultan a C,6,7. La final se fixeaz C8, apoi C9, formnd complexul de atac membranar. Fixarea lor produce leziuni ireversibile liza celulei.

Calea alternativ de activare a C Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, parazii, venin de cobr, agregate de IgA sau IgE. C1,4 i 2 nu intervin i reacia ncepe cu C3. Properdina, factorul B i ionii de Mg++ sunt obligatorii n procesul de activare pe cale alternativ.

2/15/2010

Calea lectinic de activare a C este determinat de legarea unor lectine pe unele grupri de manoz, carbohidrat prezent n componena multor mi/o i absent la ma/o. Lectina este echivalent fraciei C1q. Alte 2 molecule se asociaz, formnd o enzim similar C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza)

Componentele reaciilor de liz: - Ag (celule bacteriene, hematii, etc) - Ac (lizine - IgG i IgM) - Complement ser proaspt de cobai sau ser de cobai liofilizat Reacia de bacterioliz (RBL) - Ag suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...) - Ac serul imun sau serul bolnavului - Complement

RBL in vitro - Se efectueaz diluia succesiv a serului - Se adaug suspensie microbian vie - Se adaug complement (martor: Ag+ser fiziologic+C) - Incubare 2 h la 37C - Rensmnare pe cutii cu geloz cte 0,1 ml din fiecare diluie (24h 37 C) - Lectura se compar nr coloniilor crescute din martor i probele studiate - Titrul cea mai mare diluie a serului n care au fost lizate cel puin 50% din celule

RBL in vivo - Amestecul dintre Ag i Ac se inoculeaz intra -peritoneal la animale de laborator (ex.: oareci albi) - Peste fiecare 10 min, timp de o or, se extrage lichidul peritoneal, se pregtete un preparat nativ i se examineaz pe fond negru sau cu contrast de faz. - Rezultat pozitiv numrul bacteriilor scade treptat pn la dispariie. Utilizarea RBL diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL)

Reacia de hemoliz (RHL) - Ag hematii de berbec, suspensie de 3% - Ac ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) - Complement Principiul reaciei: complexele Ag-Ac formate fixeaz C i-l activeaz pe cale clasic, provocnd hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciaz vizual (++++) sau prin msurarea densitii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practic a RHL: pentru dozarea C, precum i n montarea reaciei de fixare a complementului.

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC) Este o reacie complex, constituit din 2 sisteme Ag -Ac i cu participarea C. n RFC particip Ig capabile s fixeze C IgM i IgG. RFC se utilizeaz n diagnosticul virozelor, infeciilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate n acelai volum fiind titrate n prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacia este nsoit de martori ai tuturor componenilor

10

2/15/2010

Reacia se efectueaz n 2 etape utiliznd 2 sisteme. I etap Sistemul de baz este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) i complement n doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37 C sau meninut 16-18 ore la 4 C. Dac Ac se combin cu Ag omolog va avea loc i fixarea C (efect frecvent invizibil).

II etap la sistemul de baz se adaug sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici serul hemolitic (Ac2). Peste 1h incubare la 37 C reacia este terminat. Evaluarea rezultatelor dac complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observ (rezultat pozitiv). Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rmne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocnd hemoliza (rezultat negativ)

Complement Fixation

Ag
Ag Ag

No Ag
Patients serum

Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcai n unele cazuri este imposibil de a detecta o reacie Ag-Ac: unii Ac nu precipiteaz, alii nici nu precipiteaz, nici nu aglutineaz, exist complexe Ag-Ac care nu fixeaz C. n aceste cazuri pot fi utilizai Ac marcai pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcani nu afecteaz proprietile lor imunologice. Aceste reacii se monteaz pe suport solid (lam, plci din plastic)

Marcanii utilizai uzual: - Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumin rou-oranj sau verde-galben la tratarea lor cu raze UV (Reacia de ImunoFluorescen) - Enzime (fosfataza alcalin, peroxidaza), capabile s modifice culoarea unui substrat (Reacia Imuno-enzimatic) - Radio-izotopi (125J sau 3H), care emit respectiv raze gamma i beta (Analiza Radio-Imun)

11

2/15/2010

Reacia de imunofluorescen (RIF, reacia COONS) Metoda direct (numai n scop de seroidentificare). Din materialul ce conine Ag (material nativ, cultur pur, biopsie tisular) se prepar un frotiu, peste care se aplic serul imun specific cu Ac marcai cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare ntr-o camer umed preparatul este studiat la microscopul luminiscent. n caz de reacie pozitiv se observ luminiscen local. Inconvenient necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag.

positive test for rabies

negative test for rabies

Metoda indirect. Poate fi utilizat pentru sero-identificare i sero-diagnostic. Pe frotiul ce conine Ag se aplic Ac corespunztori nemarcai. Peste 20 min se spal minuios preparatul, apoi se adaug anti-Ig fluorescent, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat n numeroase reacii. Anti-Ig se obine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig umane.

Tehnica fondat pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac. RIF se utilizeaz pentru identificarea rapid a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.

12

2/15/2010

Reacia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISA -Enzyme Linked Immunosorbent Assays). - RIE direct (metoda sandwich). Utilizat doar n seroidentificarea Ag. n godeurile din placa de polistiren n care sunt fixai Ac cunoscui se toarn soluia de Ag necunoscut. Se incubeaz 1h. Dup o splare minuioas a godeurilor se adaug Ac marcai cu enzime, care se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag polivalent. Dup incubare de 30 min -1h se spal iari godeurile. Prezena complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul substratului cromogen (substan iniial incolor, dar care se coloreaz sub aciunea enzimei , ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).

- RIE indirect. Utilizat n serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se ntroduce n godeu, dup 1h se spal totul i se adaug ligandul marcat cu enzim (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim). Acest ligand se fixeaz pe Ac testai. Se adaug apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se msoar dup densitatea optic a lichidului din godeuri.

- Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag sau ai Ac dintr-un amestec. I etap electroforeza n gel a probei de Ag II etap transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloz III etap pe membran sunt aplicai succesiv Ac dirijai contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzim, care permite depistarea Ac fixai. Dup o splare se adaug substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone colorate distincte. Utilizare: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...

13

2/15/2010

Proteinele sunt separate electroforetic n gel poliacrilamid. Sub aciunea cmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutii moleculare, aranjndu-se n zone liniare subiri diferite: mai aproape de start se aranjeaz proteinele cu mas molecular mare (120-150 kDa), la final se aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa). Apoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitroceluloz amplasat ntre electrozii unei surse de curent continuu. Sub aciunea cmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloz, unde se fixeaz foarte bine pe hrtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incolor. Procedura ulterioar de montare a reaciei este similar tehnicii ELISA.

Analiza radioimun (ARI) Principiul este identic cu cel al RIE Ag se fixeaz la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaug Ac testai care se vor combina cu Ag omolog. Dup splarea godeurilor, se adaug un ligand radiomarcat (anti-Ig). Dup eliminarea excesului de izotopi prin splare, se msoar radio-activitatea: ea este proporional cu concentraia Ac dozai.

Reacia de neutralizare (RN): formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor). Reacia de imobilizare Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)

14