Cromatografia

Cromatografia este metoda de separare a doi sau mai muli componeni pe baza diferenei de afinitate ntre o faz staionar i una mobil. Considernd un amestec de doi componeni x i y n soluie, y avnd o afinitate mai mare pentru faza staionar i o solubilitate mai mica n solvent, fa de x, cei doi componeni se separ. Metode de separare - metode de extracie selectiv se bazeaz pe dizolvarea selectiv a componentelor din amestecul analizat prin alegerea convenabil a unor solveni potrivii sau a unor condiii de pH adecvate - metode cromatografice se bazeaz pe partiia difereniat a componentelor probei analizate ntre dou medii nemiscibile (faza staionar-FS i faza mobil-FM), fenomen care determin mobiliti diferite ale componentelor n faza staionar - metode electrice se bazeaz pe mobilitatea difereniat a componentelor chimice posednd sarcin electric (ioni) n condiii adecvate de cmp electric, aplicat ca atare sau n combinaie cu pH potrivit (sau cu un gradient de pH) PRINCIPIUL METODEI CROMATOGRAFICE Separarea unei probe n doi componeni decurge datorit faptului c unul din componeni rmne mai mult vreme pe faza staionar a coloanei. Suprafaa de contact a fazei staionare are proprietatea de a reine componenii probei pentru scurt timp. Prin adsorbii i desorbii succesive, fiecare component se transfer din nou n faza mobil. Acest proces se repet mereu. Timpul de retenie al unei substane depinde de competiia ntre afinitatea pentru faza staionar i solubilitatea n solvent (faza mobil). Timpul necesar pentru ca substana s ajung la captul coloanei (din momentul injectrii) se numete timp de retenie, tR.

Mobilitatea diferit a componentelor se manifest prin deplasare cu viteze diferite de-alungul suportului cromatografic (sau de-alungul fazei staionare). Suport cromatografic: - hrtie poroas (cromatografie pe hrtie) - strat subire depus pe un suport plan (TLC/CSS) - coloan umplut cu faza staionar - tub capilar cu suprafaa intern acoperit cu faza staionar Clasificarea metodelor cromatografice Criterii de clasificare: 1) dup starea de agregare a fazei mobile (FM) i a fazei staionare (FS) 2) dup polaritatea fazelor (FM i FS) 3) dup mecanismul de interaciune a componentelor probei cu FM i FS 1) Dup starea de agregare a fazelor 1.1 Faza mobil gazoas (gaz cromatografie, GC) 1.1.1 Faza staionar solid (solid - gaz) 1.1.2 Faza staionar lichid (lichid - gaz) 1.2 Faza mobil lichid 1.2.1 Faza staionar solid (solid - lichid) 1.2.2 Faza staionar lichid (lichid - lichid)

2) Dup polaritatea fazelor 2.1 Cromatografie cu faza normal (FS polar, FM nepolar) 2.2 Cromatografie cu faza invers (FS nepolar, FM polar) Exemple: FS polare : silicagel, oxid de aluminiu, celuloz, Florisil FS nepolare : diferite tipuri de silicagel silanizat FM polare : metanol, acetonitril, etanol, ap, tetrahidrofuran FM nepolare : diclormetan, cloroform, hexan, benzen, toluen 3) Dup mecanismul de interaciune a componentelor cu FM i FS 3.1 Cromatografie de adsorbie (adsorbia componentelor pe FS solid, polar) 3.2 Cromatografie de partiie (partiia componentelor ntre FS i FM, ambele lichide dar nemiscibile) 3.3 Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni (interaciuni ionice ntre componente i FS rin solid) 3.4 Cromatografie de gel-permeaie (gel-filtrare) (potrivire sau nepotrivire steric a moleculelor componentelor n cavitile unui gel - FS - inert; separare dup criteriul volumelor moleculare) (cromatografie de gel-permeaie / de gel-filtrare / cromatografie de excludere steric) 3.5 Cromatografie de afinitate (interaciuni specifice, de natur biochimic, ntre componente i FS: interaciuni de tipul antigen-anticorp, enzim-substrat, enzim-coenzim, enzim-inhibitor) Caracterizarea mobilitii cromatografice a componentelor - prin distana parcurs de component ntr-un interval de timp dat (comun pentru toate componente) - n special la cromatografia n strat subire - prin timpul necesar pentru parcurgerea lungimii L a sistemului cromatografic - n special la cromatografia n coloan

Legea distribuiei Nernst La extracia unui component ntre dou faze nemiscibile, specia dizolvat se distribuie ntre cele dou faze nemiscibile. Legea distribuiei Nernst: raportul concentraiei speciei n cele dou faze este constant, la temperatur constant. K = C1/C2 T = ct. K=D coef.de distribuie lichid-lichid la cromatografia de distribuie lichid-lichid Coeficientul de distribuie Nernst Kms depinde de : - natura componentei repartizate ntre FS i FM - natura fazelor FM i FS - temperatura de lucru - mecanismul de interaciune cu FS i cu FM Cu ct coeficienii de distribuie Nernst ai substanelor sunt mai mari i mai diferii ntre ei, cu att separarea pe coloan mai bun.

Separarea probei n componeni individuali decurge la suprafaa particulelor poroase, strns mpachetate. Avantajul particulelor poroase este raportul mare ntre suprafaa i volumul lor. 500 m2 (pentru pori de 6 nm) i 10 m2 (pentru pori de 400 nm), per gram de material de umplutur.

Faza mobil curge printre spaiile libere dintre particulele umpluturii coloanei. Componenii fazei mobile staioneaz n porii particulelor i se separ pe baza diferenei dintre timpii lor de retenie. Silicagelul reprezint un important material hidrofil. Caracteristica major a silicagelului este prezena grupelor hidroxil polare, legate de atomii de siliciu de la suprafa. Grupele hidroxil, care formeaz interfaa fazei staionare, sunt polare reinnd pentru scurt timp substanele, prin adsorbie pe grupele polare. Adsorbia este cu att mai puternic cu ct este este mai polar molecula. Astfel molecula de fenol polar este adsorbit mai puternic dect n-octanul nepolar care se elueaz mai repede. Solventul componenilor este unul slab sau mediu polar.

Silicagel faza normala

Separarea pe silicagel faza normala a doi component cu polaritati diferite

Silicagelul faz invers se obine din silicagel polar prin modificri chimice ale suprafeei. Grupele polare hidroxil sunt nlocuite cu grupe funcionale nepolare ca: n-octadecil, noctil, metil, fenil. Caracterul hidrofob crete cu creterea lungimii lanului legat.

Silicagel faza inversa Factorul de retenie (ntrziere) Gradul de migrare se exprim prin valoarea Rf (retardation factor) factor de retenie sau de ntrziere, calculat cu relaia:
dis tan ta . parcursa .de .component dis tan ta . parcursa .de .solvent tim pul .de .trecere . prin .coloana .a.solventulu i Rf = timpul .de .trecere . prin .coloana .a.componentu lui Rf =

Distana parcurs de component se msoar de la punctul de start pn la mijlocul zonei solutului, iar distana parcurs de solvent de la locul de aplicare al spotului pn la frontul solventului Factorul de retenie sau de ntrziere este o mrime adimensional i are valori ntre 0 i 1 Rezultatul analizei cromatografice este nregistrat ca o cromatogram. De ex. pentru o prob coninnd doi componeni, plasat ntr-o coloan cromatografic, se obine o curb cu profilul curbei Gauss pentru fiecare component separat. Aceast curb este denumit peak. Momentul t = 0 corespunde injectrii probei. nlimea peak-ului H, este o msur a concentraiei componentului eluat.

Timpul de retenie net: tR = tR - tm tm intervalul de timp de la injectarea probei pna la eluarea componentului nereinut Metoda tangentelor WB = limea la baz a peak-ului WH = limea la jumtate din inlimea peak-ului Limea la baz se determin grafic trasnd tangentele i msurnd distana dintre punctele de intersecie cu linia de baz.

A= aria peak-ului este proporional cu concentraia substanei i se folosete n analiza cantitativ A = H x WH Izoterma de distribuie 1.Curba de eluare este simetric i gaussian cnd distribuia componentului ntre cele dou faze se face corespunztor constantei de echilibru: Coeficientul de distribuie Nernst: Km/s=Cm/Cs Izoterma de distribuie liniar Cm=Km/s*Cs Izoterme de distribuie neliniar Cs=K*Cm 2. <1 3. >1 Conceptul talerelor teoretice Numrul de talere teoretice este o msur a capacitii de separare a coloanei: cu ct este mai mare numrul de talere teoretice, cu att este mai mare capacitatea de separare a coloanei i mai mic limea la baz a peak-ului. H=(2...5)xdiam.particulelor H=2x5m=10m H= 5x5m=25m L 100 mm N= = = 10 .000 H 10 x10 3 mm
N= L 100 mm = = 4.000 H 25 x10 3 mm

Msura cantitativ a eficienei coloanei de separare este numrul de talere teoretice N. Cnd o coloan de separare eficient d peak-uri nguste la baz sau la jumtate din nlime, rezult o valoare relativ mare a N, la timpi de retenie egali, prin comparaie cu o coloan neeficient.

Rezoluia cromatografic este o msur a gradului de separare a dou peak-uri vecine.

t R 2 t R1 2t = WB1 +WB 2 WB1 +WB 2 2 FRXpag .1.049 t t R = 1,18 x R 2 R1 b0,5 a + b0, 5b R=

Rezoluia cromatografic

R=

t R 2 t R1 2t = WB1 + WB 2 WB1 + WB 2 2

Coeficientul de selectivitate Coeficientul de selectivitate sau selectivitatea exprim capacitatea coloanei de a separa dou substane. Selectivitatea coloanei de separare este raportul timpilor relativi de retenie Sau raportul factorilor de capacitate Sau raportul coeficienilor de distribuie Nernst-datorit relaiei de proporionalitate dintre factorul de capacitate k i coeficientul de distribuie Nernst K

t R 2 t m t ' R 2 k '2 K 2 = = = t R1 t m t ' R1 k '1 K1

k'=

t 'R t R tm = tm tm

Cromatografie cu faza mobil lichid FS - solid (mai rar) sau lichid (mai frecvent) FM - lichid (solvent unic sau amestec de solveni) n cromatografia lichid se realizeaz: - separarea (analitic sau preparativ) a componentelor unei probe - identificarea calitativ a componentelor pe baza mobilitii cromatografice (timp de retenie) - analiza cantitativ a componentelor din prob Variante : - FS n forma de strat subire, ntins pe un support plan (TLC) - coloan cu umplutur (scop analitic sau preparativ) Regim de lucru : - cu compoziie constant n timp a FM ( regim "izocratic" ) - cu compoziia variabil n timp a FM ( regim cu "gradient" ) Cromatografie n strat subire-CSS 6

este tehnica citat frecvent n Farmacopeea Romn i n cele ale altor ri (inclusiv Farmacopeea European). Avantaje : - rezoluie bun (mai ales cu variantele actuale, performante) - posibilitatea analizrii mai multor probe n condiii strict identice - posibilitatea separrii "bidimensionale" a componentelor din prob - se realizeaz prin operaii simple (nu necesit specializare deosebit) - literatura de specialitate conine multe informaii privind condiiile de lucru - dotarea cu tehnica TLC nu presupune efort financiar deosebit Stratul subire (FS): - silicagel - oxid de aluminiu (Al2O3) cu umiditate controlat - celuloz - acetat de celuloz Identificarea / vizualizarea componentelor pe placa cromatografic : - prin mrimile RF i RM - prin rzuirea spotului, urmat de extracia componentei i identificarea prin metode fizico-chimice (ex. IR) prin pulverizarea plcii cu reactivi de culoare specifici componentelor prin modificarea fluorescenei stratului subire Analiza aminoacizilor prin derivatizare cu ninhidrin FS-strat subire silicagel FM-soluie de fenol Revelator-soluie ninhidrin 0,1% n etanol Aminoacizii ciclici (ca alfa-prolina) nu pot fi identificai cu ninhidrin Aminoacizii reacioneaz cu ninhidrina, conform reaciilor: Produsul de condensare dintre un mol de ninhidrin redus i un mol de ninhidrin, n mediu amoniacal, este colorat i indic prezena aminoacizilor n prob.

Analiza aminoacizilor prin derivatizare cu 9-fluorenilmetil cloroformiat (FMOCCl) Derivatizarea cu FMOC-Cl se poate aplica aminoacizilor primari i secundari. 7

Nu este susceptibil interferenelor majore cu alte substraturi. Derivaii rezultai sunt foarte stabili i puternic fluoresceni, cobornd limita de detecie la nivelul fmol (femtomolar). ex = 270 nm em = 316 nm 1.Elimin necesitatea extraciei simplificnd procedura i dovedind acurateea analizei cantitative a aminoacizilor hidrofobi. 2.Se formeaz un singur produs, stabil, ceea ce permite analiza cantitativ a tuturor aminoacizilor, inclusiv histidina i tirosina. 3.Se elimin interferena cu ali reactivi sau ali solveni. 4.Detecia n UV la 270nm sau emisie fluorescent la 316nm.

Determinarea aminelor prin derivatizare cu fluorescamin Un alt agent de derivatizare care prin condensare cu gruparea amino exalt fluorescena produsului este fluorescamina Detecia: ex = 360nm em = 440nm

O O

Determinarea HPLC a aflatoxinelor Micotoxine-derivai cumarinici aflatoxine Detector de fluorescen ex = 360nm em = 420nm

Produsele vegetale cu poliholozide mixte la umiditate crescut devin medii de cultur pentru microorganisme (bacterii, mucegaiuri, ciuperci) degradarea principiilor active i biosinteza diferitelor substane toxice numite micotoxine.

Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni Rinile schimbtoare de ioni se clasific : - dup natura speciilor ionice schimbate - cationii (schimb cationi; grupele ionizabile, legate chimic de rin, au sarcina electric negativ) - anionii (schimb anioni; grupele ionizabile, legate chimic de rin, au sarcina electric pozitiv) - dup tria acid (bazic) a gruprilor ionice legate de rin - cationit / anionit tare - cationit / anionit slab Un cationit este n " forma H " dac ionul reinut pe suprafaa lui (prin inter-aciuni electrostatice cu gruprile legate chimic de rin) este protonul, H+. Dac acest ion este dislocat din vecintatea grupelor legate de rin cu ali ioni, de exemplu cu Na+, atunci cationitul este n " forma Na ". Un anionit este n " forma OH " dac ionul reinut pe suprafaa lui (prin in-teraciuni electrostatice cu gruprile legate chimic de rin) este ionul OH-. Dac acest ion este dislocat din vecintatea grupelor legate de rin cu ali ioni, de exemplu cu Cl-, atunci anionitul este n " forma Cl ". Ionii Na+, prezeni n soluie, disloc protonul din gruparea sulfonic a rinii i sunt fixai, prin fore electrostatice, n sfera de solvatare a anionului sulfo-nat. Protonul trece n soluie n forma disociat (electrolit tare). Procesul este reversibil. Echilibrul nu este deplasat pre-dominant ntr-un anume sens. Dac n urma dislocrii proto-nului, acesta trece n soluie n forma de electrolit slab (con-centraia de H+ mic), atunci echilibrul este deplasat spre " forma Na " a rinii. + Rin insolubil SO3 H + ( Na +Cl ) " form H " a electrolit tare

Rin insolubil " form Na " a

SO3 Na+ + ( H++Cl- ) electrolit tare

Rin insolubil " form H " a

SO3 H

+ ( Na++OH )
electrolit tare

Rin insolubil " form Na " a

SO3 Na+

+ H2O electrolit slab

Un anionit este capabil s schimbe anionul reinut n sfera de solva-tare a grupei active (un cation cu sarcina electric pozitiv) cu un alt anion, aflat la concentraie suficient de mare n mediul cu care rina este n contact. Anioniii au gruparea ac-tiv cu caracter bazic (n funcie de tria bazic a grupei active, anionitul poate fi tare sau slab). Rinile schimbtoare de ioni rein ionii
Rin insolubil NR3 Cl
+

+ ( Na++OH- ) e ctrolit tare le

" form Cl " a

+

Rin insolubil

NR3OH

+ ( Na++Cl- ) e ctrolit tare le

" form OH " a

Valorile optime ale parametrilor cromatografici

Nr.crt.
1

Parametrul
Legea Lambert-Beer Exprim proprietatea speciei de a absorbi radiaia Legea distribuiei Nernst Arat de cte ori este mai solubil componentul, n solventul 1 dect n solventul2 Timpul de retenie net Aria peak-ului Proporional cu concentraia Factorul de asimetrie Reflect simetria peakului Factorul de coad Reflect simetria peakului

Relaia de calcul
A = axbxC

Valorile optime
0,1-0,8 AU

K = C1 /C2 T = ct. tR = tR - tm A = H x WH

K>>1

3 4 5 6

1-15 min. Valori ct mai apropiate de 1 Valori ct mai apropiate de 1

AS =
T =

B10% H A10% H
W0 , 05 2f

T=
7 Numrul de talere teoretice Eficiena de separare a coloanei

A5% H + B5% H 2 A5% H

2 2

t N = 5,54 R W H t N = 16 R W B
t N = 25 R W 4, 4

N=4.000-10.000 pentru o coloan cu lungimea de 100 mm i dim. particulelor 5 m N=6.000-15.000 pentru o coloan cu lungimea de 150 mm i dim. particulelor 5 m n=40.000-100.000 H=10-25 m pentru particule de 5 m

8 9

Numrul de talere/metru nlimea talerului teoretic

n=N/L H=L/N

10

Cu ct este mai mic H, cu att este mai ngust peak-ul 10 11 Factorul de capacitate Abilitatea coloanei de a reine componentul Selectivitatea Reflect capacitatea coloanei de a separa doi componeni Rezoluia cromatografic Arat ct de bine sunt separate peak-urile

L WH H= * 5,54 t R
k =

H=(25)xdiam.particulelor

t 'R t R tm = tm tm

1-15 .> 1 R>1 Pt. R = 1,5 Separare net

t R 2 t m t ' R 2 k '2 K 2 = = = t R1 t m t ' R1 k '1 K1

12

R=

t R 2 t R1 2t = WB1 + WB 2 WB1 + WB 2 2
1 k' N * * k '+1 4
H(u) = A + B / u + C u

R=
13 Ecuaia Van-Deemter nlimea talerului teoretic n funcie de viteza liniar a fazei mobile

Difuzia Eddy...............................A Difuzia longitudinal...................B / u Factorul de transfer de mas.C u

H(u) are valoare minim pentru: u= 2-3 mm/s pentru particule de 5 m

Factorul de asimetrie
B B10% H = A A10% H A = distana de la axa vertical a peak-ului pentru maximul de concentraie, pn la frontul peak-ului, msurat la 10% din nlimea peak-ului; B = distana de la captul peak-ului pn la axa vertical a peak-ului pentru maximul concentraiei, msurat la 10% din nlimea peak-ului. AS =

A5% H + B5% H 2f 2 A5% H f = distana dintre axa corespunztoare maximului peak-ului i frontul peak-ului; W0,05 = distana dintre axa corespunztoare maximului peak-ului i captul cozii, msurat la 5% din nlimea peak-ului (fa de linia de baz).
T = W0 , 05

Factorul de coad
;T=

11

Peak 2 Peak 1

H Peak nere inut W0,05 0,05 H

Reprezentarea grafic a dou peak-uri i a parametrilor care intr n calculul asimetriei peakului i a factorului de coad

12