COMPUȘI CHIMICI

DE BIOSINTEZĂ
ACIDUL CITRIC
 Acidul citric
 a fost izolat pentru prima dată din sucul de lămâie de către
chimistul suedez Carl Scheele în 1784;
 este un produs intermediar de metabolism aproape universal,
fiind prezent în urme în aproape toate plantele şi animalele;
 prima producţie comercială din sucul de lămâie a fost
înregistrată în Anglia în 1826;
 în 1893 Wehmer remarcă acumularea de acid citric într-un
mediu cu conținut de zaharuri în prezența fungilor Citromyces
 în 1917 Curie descoperă că anumite tulpini de Aspergillus niger
prezintă o creştere abundentă, iar în timpul creşterii produc
cantităţi mari de acid citric;
 în 1923, în SUA., are loc dezvoltarea primei producţii industriale
de acid citric și se datorează companiei Pfizer;
Domenii de utilizare
- se bazează pe proprietățile sale acidulante,
conservante, antioxidante, potențare de
arome, dar și de chelare
 Microorganisme producătoare
 pe substraturi zaharoase: Mucor piriformis, Penicillium luteum, P.citrinum, P.
restrictum, Talaromyces sp., Apergillus niger, A. clavatus, A. wentii, A. fumaricus, A. awamori,
A. nidulans, A. fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus,Trichoderma viride etc.
 din fracţiuni de n-parafine: Arthrobacter paraffineus, specii de Corynebacterium,
Penicillium restrictum şi diferite specii de drojdii din familia Candida (lipolytica,
oleophila, citrica)
 au fost utilizate la scară industrială pe diferite substraturi speciile Candida incluzând
C. tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii şi C. intermedia– dezavantaj: produc alături de
acid citric cantități destul de importante de acid i-citric;

 importanţă practică prezintă numai Aspergillus

niger, datorită obţinerii unor randamente ridicate
de acid citric dintr-o gamă destul de variată de
substraturi zaharoase.
Biochimia acidului citric
Ciclul Krebs
Materii prime
Sursă de carbon:
 gamă bogată de materii prime cu conţinut de mono- sau dizaharide
(glucoza, fructoza, zaharoza, maltoză) ca melasa de sfeclă,
respectiv trestie de zahăr, hidrolizate de amidon, melasă de citrice,
deşeuri de fructe (ananas, fructe palmier după extracţia uleiului)
subproduse din industria berii.
 se impune purificarea melasei, care poate fi realizată fie prin reţinere
pe schimbători de ioni, cărbune activ, bentonită, fie prin precipitare
cu ferocianură de potasiu şi acid sulfuric la 80 – 100 0C / 15 min.
 mutanţi de Yarrowia lipolytica au fost testaţi cu succes pe
substraturi cu glicerină rezultată de la fabricarea de biodiesel, ape
reziduale de la fabricarea uleiului de măsline, sau deşeuri de
ananas.

Materiile prime complexe, nu necesită suplimentare de sursă de azot.

În mediile simple sursa de azot este asigurată de amoniac sau săruri
de amoniu (azotat sau sulfat), care pot fi suplimentate cu surse
organice de azot (extract de porumb, hidrolizate proteice).
Tehnologii de fermentaţie
 Cultura de suprafață

 Cultura submersă

 Cultura în fază solidă

 Tehnologii de fermentaţie
Cultura de suprafaţă
 Materia primă: melasă, purificată, diluată până la o concentraţie de
zahăr de aprox. 15 %, iar pH = 5 - 7;
 Inocularea se realizează direct cu spori;
 Fermentator celular - celulele fermentatorului au o capacitate de 50 –
100 L şi o suprafaţă de 5 m2, grosimea stratului de mediu 5 - 20 cm;
 Temperatura 28-300C;
 pH-ul după 24 h scade la valoare 2;
 Aerare cu aer steril, umiditate 45 - 60%, debit variabil funcţie de faza
de creştere;
 Producţia de acid citric începe după 2-4 zile;
 Durata: 8 – 15 zile;
 Randament: 70-95% (57 - 77% din cel teoretic);
 Productivitatea trebuie să fie de peste 1 kg ac. citric/ (m2 strat
micelar×zi).
Schema de principiu a instalației de fabricare a acidului citric
din melasă prin cultură de suprafață

1.- vas preparare substrat;

2.- filtru de aer;
3.- saturator;
4.- preîncălzitor aer;
5.- fermentator celular;
6.- vas colector mediu;
7, 11, 13.- filtre;
8.- vas spălarea micelii;
9.- vas colector filtrat;
10.- vas precipitare citrat
de calciu (se face cu
hidroxid de calciu);
12.- vas acidulare;
14.- rezervor acid brut;
15.- filtru presa;
16.- evaporator;
17.- cristalizor
 Cultura submersă
 înlătură principalele dezavantaje ale culturii de suprafaţă, necesită manoperă
mai mică, ocupă un spaţiu mai redus şi conduce la productivităţi mai mari;
 fermentatoarele, de diferite tipuri constructive (cu amestecare mecanică, tip
coloană sau air-lift) sunt confecţionate din oţel inoxidabil de înaltă puritate,
datorită mediului puternic acid şi a capacităţii acidului citric de a dizolva ioni
metalici; sunt echipate cu sisteme eficiente de aerare;
 sursă de carbon: - se utilizează atât melasă cât şi hidrolizate de amidon, a
căror concentraţie în substrat se fixează la 15 - 20%.
 inoculul se prepară într-un reactor de mică capacitate, în care condiţiile sunt
modificate în sensul favorizării unei etape rapide de creştere, etapă care
durează 18 - 30 h.
 Fermentaţiile se desfăşoară în fermentatoare de 100 - 200 m3, la temperaturi
de cca. 300C.
Principalii factori de influenţă în fermentaţia citrică sunt:

 compoziţia mediului de cultură

• natura şi concentraţia sursei de carbon;
• concentraţia de azot şi fosfor;
• concentraţia de microelemente Zn, Mn, Fe, Cu, metale grele
şi metale alcaline;
• anumiţi nutrienţi trebuie să fie în exces (zaharide, oxigen),
altele trebuie limitate în mediu (azot şi fosfor), iar unele
componente ale materiei prime trebuie să rămână sub
anumite limite bine definite (de ex. urmele de metale, în
special Mn).
• monozaharidele (glucoza şi fructoza), care rezultă din
hidroliza zaharozei din melasă nu sunt echivalente din punct
de vedere al asimilării de către fungi. Fructoza este asimilată
mai lent, iar viteza sa de asimilare scade semnificativ o dată
cu acumularea în mediu a acidului citric.
Compoziţia substratului în culturile submerse

Component, g/L Etapa de sporulare/ Etapa de producţie

creştere
Zaharoză 140 140
Bactoagar 20 0
NH4NO3 2.5 2.5
KH2PO4 1.0 2.5
MgSO4×7H2O 0.25 0.25
Ioni de Cu 4.8×10-3 6×10-5
Ioni de Zn 3.8×10-3 2.5×10-4
Ioni de Fe 2.2×10-3 1.3×10-3
Ioni de Mn 1×10-3 1×10-3
 morfologia fungilor filamentoşi variază între peleţi şi filamente libere,
funcţie de condiţiile de cultură, respectiv de tulpina producătoare.
 amestecarea intensă este asociată cu formarea de filamente scurte,
groase şi puternic legate, care au o productivitate ridicată de acid
citric. O amestecare intensă poate conduce la ruperea filamentelor.
În culturile de Aspergillus niger s-au observat cicluri de fragmentare
micelială şi recreştere, fenomene favorabile producţiei de acid citric.
 formarea de peleţi prezintă ca avantaj o mai facilă amestecare,
consumul energetic fiind mai redus. Trecerea de la forma de peleţi la
un miceliu filamentos conduce la o scădere cu 50% a concentraţiei
de oxigen dizolvat la un debit constant de aer.
 utilizarea microorganismului producător (miceliu de Aspergillus niger)
în formă imobilizată pe diferite suporturi (spumă poliuretanică, perle
de alginat, agar, colagen, gel de poliacrilamidă etc), atât în culturi de
suprafaţă cât şi în culturi submerse, conduce la obținerea unor viteze
mai mari de producere a acidului citric, în special la concentraţii mai
mari de glucoză. De asemenea, este atractivă posibilitatea
recirculării biomasei.
 pH-ul mediului de cultură este important în două etape diferite ale
fermentaţiei. În etapa de germinaţie a sporilor pH-ul mediului
trebuie să fie mai mare de 5, în timp ce în etapa de producere a
acidului citric necesită un mediu puternic acid, pH ≤ 2. pH-ul
puternic acid previne contaminarea culturii cu alte microorganisme
şi inhibă formarea unor produse secundare nedorite (acid gluconic,
oxalic), facilitând separarea acidului citric din mediul de
fermentaţie.

 Aerarea este un factor semnificativ care afectează costul de

producţie. Producătorii de acid citric au constatat faptul că variaţii
ale gradului de aerare în culturile discontinue poate avea efecte
dramatice asupra producţiei de acid. În practica industrială se
realizează un grad relativ redus de aerare în etapa iniţială (0.1
m3/(m3 mediu×min)), mărindu-se apoi în etapa de creştere la 0.5 –
1 m3/(m3 mediu ×min). La un asemenea grad de aerare apare
fenomenul de spumare pentru limitarea căruia se utilizează diferite
dispozitive şi agenţi antispumanţi.
 Schema instalaţiei submerse de fabricare a acidului citric
1.substrat; 2, 9. coloane demineralizare; 2a. pasteurizator; 2b. răcitor;
3. inocul; 4. fermentator; 5, 6, 8, filtre; 7. vas acidulare; 10. coloana decolorare
carbune activ; 11, 14. evaporator; 11a, 14a, cristalizor; 12, 15. centrifuga;
13. vas dizolvare, 16. uscător; 17. ambalare
Cultura în fază solidă
- S-a dezvoltat în Japonia pe deșeuri de fructe și de orez. Ulterior
au fost testate resturile de sfeclă, respectiv trestie de zahăr, care au
un preț scăzut dar oferă o suprafață mare de dezvoltare pentru
microorganisme.
- După sterilizare cu abur, suportul este îmbibat cu mediul de
cultură, în care drept sursă de carbon se folosește amidon sau
celuloză și se inoculează prin sprayere cu spori de A. niger.
Mucegaiul produce suficiente celulaze și amilaze pentru hidroliza
sursei de carbon.
- Temperatura de incubare este de cca. 300C.
- Durata procesului este de 4-5 zile.
- Dezavantajul procedeului constă în randamentele scăzute.
 Separarea acidului citric
din mediile de fermentaţie
Metoda precipitării

Dezavantajele procedeului:
• consum mare de reactivi chimici
(var-579 kg/t, acid sulfuric-765
kg/t) și 18 m3 de apă;
•obtinerea unor cantitati importante
de deseuri (sulfat de calciu-
aprox.1t/t acid citric)
Procedee alternative de separare a
acidului citric
 Extracţia cu solvenţi, insolubili sau cu o solubilitate extrem de
redusă în apă. Drept solvenţi a fost testată o gamă variată de
compuşi organici (alcooli, cetone, esteri, eteri, compuşi
organo-fosforici, amine), datorită însă toxicităţii acestora, doar
procedeele utilizând amine au aviz favorabil de utilizare pentru
industria alimentară, respectiv farmaceutică.

 Separarea pe schimbători de ioni este fezabilă doar în cazul

utilizării unor materii prime cu puritate ridicată. Se pot utiliza
anioniţi slab bazici, impregnaţi cu amine terţiare sau piridină,
sau anioniţi puternic bazici, cu grupe funcţionale cuaternare de
amoniu. Necesarul mare de efluent, obţinerea de soluţii
diluate de acid citric şi necesitatea regenerării schimbătorului
de ioni rămân ca principalele tare ale procedeului.
 Extracţia reactivă în care diverşi extractanţi organici complexează
reversibil cu acizii. Drept extractanţi pentru acidul citric se pot
utiliza aminele terţiare care au dat cele mai bune rezultate în
extracţia cu solvenţi.
Dintre avantajele procedeului se pot enumera:
 realizarea unor grade avansate de recuperare (de peste 97%)
chiar şi la o singură contactare, cu posibilitatea realizării unei
concentrări concomitent cu etapa de extracţie,
 consumul energetic mai redus,
 generarea unor cantităţi mai reduse de deşeuri,
 un volum mai mic al instalaţiei de separare.

Datorită obţinerii unor grade avansate de recuperare şi a realizării

concomitent a concentrării acidului citric, procedeul are mari
perspective în recuperarea acidului citric din soluţii diluate.
 Separarea prin electrodializă, utilizând membrane bipolare,
realizează un grad avansat de recuperare. Procedeul nu cunoaşte
încă o aplicare la scară industrială în special datorită consumului
relativ ridicat de energie, a costului şi duratei de viaţă a
membranelor.

 O separare şi concentrare continuă a acidului citric din mediile de

fermentaţie se poate realiza prin ultra-, respectiv nanofiltrare.
Aceste procedee membranare pot fi extrem de benefice la scară
industrială pentru recuperarea acidului citric datorită avantajelor
pe care le prezintă:
◦ consum energetic scăzut,
◦ lipsa de deşeuri în comparaţie cu metodele chimice convenţionale şi
◦ posibilitatea realizării lor în flux continuu.
Cu toate acestea necesită încă studii de verificare şi optimizare la
scară pilot şi industrială.