Biofarmacie și farmacocinetică

Prelegera Nr. 11

Anticorpi monoclonali
(generaţia 3 de transportori

• Antigen- Antigen (greacă: anti=contra și geano=a naște, a

genera) este termenul care definește orice substanță de origine
endogenă sau exogenă, care, odată ajunsă în organism, nu este
recunoscută ca proprie și determină apariția unui răspuns
imun, ce vizează neutralizarea și eliminarea ei. Odată pătrunse
în organism antigenele pot determina:

• Sinteza de molecule de anticorpi, care le recunosc specific.

• Instalarea memoriei imunologice ("amintirea" organismului

despre întâlnirile anterioare avute cu același antigen).

• Apariția eventuală a unor reacții imune aberante: reacții

alergice, autoimune etc.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

Anticorp- proteină a serului sanguin secretată de către
plasmocite, provenite din limfocite de tip B (globule albe
care intervin în imunitatea celulară) ca reacţie la
introducerea în organism a unei substanţe străine
(antigen).
Sinonime: imunoglobulină; gamaglobulină
Clon (ă) – ansamblu de indivizi (bacterii, celule, virusuri
etc.) care provin dintr-un individ unic.
Anticorpi policlonali
Sunt anticorpi secretaţi de linii de celule B în organism ( în timp ce
anitcorpii monocolonali provin dintr-o singură serie de celule).

Anticorpi monoclonali
Anticorpii monoclonali sunt anticorpi care recunosc un singur tip
de epitop al unui antigen dat. Aceşti anticorpi sunt prin definiţie cu
aceiaşi structură, identici şi sunt produşi de o singură clonă de
plasmocite.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Date istorice despre descoperirea și dezvoltarea anticorpilor monoclonali.

Primul pas - În anul 1890 savantul german Emil Behring, împreună

cu cercetătorul japonez Sibasaburo Kitasato au descoperit că
animalele neimunizate pot fi protejate de toxina bacteriană a difteriei
prin injectarea antitoxinei (ser antitoxic) al animalelor imunizate. În
1901, Emil Behring a primit Premiul Nobel pentru munca sa în
domeniul terapiei cu ser.

A doua etapă –descifrarea și descrierea structurii AC (anii 30-70, sec.

XX).
În anii 30 a apărut ultra-centrifugarea și a permis separarea
anticorpilor după mărime și formă. În anii 40 oamenii de știință au
perceput să repartizeze anticorpii după sarcina electrică și
dimensiuni. Doar în 1962 Porter Rodney a descris detaliat structura
de bază a anticorpilor (a arătat că AC este alcătuit din lanțul ușor și
cel greu, din porțiunea variabilă și cea stabilă).

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Lanțul ușor Porțiunea
variabilă

Lanțul greu Porțiunea

constantă

Structura unui anticorp, pentru care savanții Rodney Porter

și Gerald Edelman, în anul 1972 au primit Premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Schema unui anticorp

COOH COOH
Resturile
Lanţuri de Lysyl
legătură distribuite pe
disulfidice peretele
moleculei
-S-S- anticorpului

NH2 Locurile posibile

NH2
NH2 de legătură a
Medicamentului
NH2
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
Al treilea pas - dezvoltarea primei tehnologii de sinteză a
anticorpilor monoclonali (anii 70-80 ai secolului XX). Obținerea
producerii rapide ACM în condiții de laborator a fost reușită numai
în anul 1975 de către savanții Georges Kohler și Cesar Milstein
Tehnologia cuprindea mai multe etape:
1. Imunizarea animalelor de laborator (producerea imunității la
șoarece fața de un antigen cunoscut);
2. Preluarea celulelor producătoare de anticorpi din splina
șoaricelui (limfocite tip B);
3. Legarea (unirea) B limfocitelor cu celulele milelom prin
tehnologia specială cu obținerea hibridomului, care poate sintetiza
în mod continuu AC împotrivă antigenului cunoscut și specific în
cantități foarte mari.
AC structural indentici - așa numiți monoclonali (produse de la o
singură celulă - mamă). Cu timpul metoda lui Kohler și Milstein a
fost îmbunătățită și în anul 1984 savanții împreună cu Neils Jerne
au primit Premiul Nobel pentru rolul său în crearea anticorpilor
monoclonali.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Prof. Niels Kaj Jerne, prof. Georges J. F. Kohler, prof. Cesar Milstein

Etapa a patra- utilizarea anticorpilor monoclonali sintetizați în

tratamentul bolilor (anii 80- sec. XX).
În anul 1979 pentru prima dată Philip Stashenko și Lee Nadler au
aplicat anticorpii monoclonali, sintetizați artificial din celule de
șoareci, împotriva antigenelor de pe suprafața celulelor
cancerigene. Au apărut dificultăți prin faptul că anticorpi murine
se legau într – un grad minor cu antigenele tumorale, și erau
percepute de organismul uman ca celulele străine. În anul 1986
pe piața farmaceutică a fost lansat preparatul «Ortoklon OKT 3 »
(muromonab) de către firma Janssen.
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
 Medicamentul era capabil să oprească reacția de respingere
a transplantului de rinichi, oferind un efect imunosupresor
selectiv. Ortoklon avea originea complet murină, adică
sintetizat prin fuziunea limfocitelor B și mielomului de
șoarece. În curînd după comercializarea preparatului s- a
descoperit faptul că la utilizarea îndelungată a anticorpilor
monoclonali murini eficacitatea lor scade considerabil.
Acest lucru poate fi explicat prin aceea că proteinele murine
reprezintă imunogenitate pentru organism uman și sunt
percepute ca substanțele străine. În acest sens la pacienții
care administrau muromonab foarte repede se produceau
anticorpi umani anti- murini (human antimurine antibody-
HAMA).

 HAMA = human anti-mouse antibodies; dupa 10-14 zile;

eruptie cutanata (urticarie);
 bronhospasm;
 hipotensiune;
 șoc anafilactic

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

Pasul cinci – crearea anticorpilor himerici (anii 90-
secolul XX).
La începutul anilor 90 utilizând metodele molecular-
biologice bazate pe tehnologia ADN- ului recombinant au
fost sintetizați anticorpi monoclonali himerici.

În preparatele din acest grup porțiunea « șoarece » a

moleculei a fost înlocuită cu una de origine umană, prin
metode ingineriei genetice.

Datorită acelui fapt că secvența proteică a unui anticorp

himeric era compusă în 75% din aminoacizi «umani» la
pacienții tratați cu astfel de medicamente HAMA-
anticorpi se formau în cantități mult mai mici, fața de cei
murini, faptul care a făcut anticorpi monoclonali himerici
semnificativ mai eficace.
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
În timp scurt pe piața farmaceutică au fost lansat un
număr mare de preparate pe baza de anticorpi himerici,
spre exemplu:
«MabThera», «Rituxan» (rituximab- pentru tratamentul
cancerului),
«Remicade» (infilximab- pentru tratamentul bolii Crohn),
«Reopro» (abciximab- profilaxia anginei pectorale și
infarctului miocardic acut).
După elaborarea anticorpilor himerici cei murini aproape
nu se mai întrebuințau și astăzi dintre toate preparatele
medicamentoase din grupul anticorpilor monoclonali
aprobate pentru întrebuințare numai trei sunt murine-
«Ortoclon OKT 3» (Muromonad- CD 3), «Zevalin»
(tiuxetan ibritumomab) și «Bexar» (tositumomab iod-
131).

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

Al șaselea pas – crearea anticorpilor umanizați și umani
(sfîrșitul secolului XX- începutul XXI).
La sfîrșitul anilor 90 a devenit posibilă minimalizarea la
maxim a procentului secvențelor de aminoacizi murini
și astfel au fost obținuți anticorpi umanizați, cu o
imunogenitate și mai mică pentru organismul uman:
«Herceptin» (trastuzumab- pentru tratamentul
cancerului de sîn și cancerul gastric),
«Xolair» (omalizumab- pentru tratamentul astmului
bronșic atopic și rinitei alergice sezoniere),
«Raptiva» (efalizumab- tratamentul psoriazisului)
precum și multe altele.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

În anii 2000 perfecționarea metodelor ingineriei
genetice au condus la un rezultat mult așteptat-
obținerea anticorpilor monoclonali umani. Actualmente
ele reprezintă cel mai mare inters terapeutic și sunt în
majoritatea cazurilor create prin tehnologia șoarecelui
transgenic (șoareci crescuți special folosind
fragmentele de ADN străin) sau prin prezentarea în fagi
(o metodă specială cu utilizarea de virusuri-
bacteriofagi).
Exemple: «Benlista» (belimumab- tratamentul lupusului
eritmatos),
«Ervoy» (ipilimumab- tratamentul melanomului),
«Simponi» (golimumab- pentru tratamentul artritei
reumatoide, artritei psoriazice).

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 TEHNICI DE INGINERIE GENICĂ

• Soareci transgenici (gene pentru

imunoglobuline (Ig) umane)
• ACM himerici:
– Regiuni variabile murine
– Regiuni constante umane
• ACM umanizati:
– Regiuni hipervariabile murine
– 95% umani
• Bacteriofagi/plasmide

Biofarmacie și farmacocinetică
 Avantaje și dezavantaje ale preparatelor pe baza de anticorpi monoclonali.

Avantaje:
•Omogenitate- anticorpii monoclonali sunt molecule identice cu
aceleași funcții.

•Specificitate- produse de către o singură celulă de hibridom ele

reacționează cu același epitop pe antigenul specific.

•Selectivitate- este posibilă alegerea unui anumit epitop specific și

generarea anticorpilor împotriva unei game mai vaste de
determinanți antigenici.

•Producerea- dintr- un singur reactiv monospecific bine definit se

obțin cantități nelimitate de anticorpi monoclonali.

•Toxicitate scăzută (spre exemplu în tratamentul cancerului

deosebit de importantă este capacitatea anticorpilor de a se lega
de celulele canceroase activând sistemul imunitar care induce
moartea celulelor tumorale (apoptoza).
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
Dezavantaje:

•Anticorpi monoclonali sunt molecule mari, complexe

cu permeabilitatea scăzută fața de membrana
plasmatică. Ele nu sunt capabile să pătrunde adânc în
țesuturi și nu pot lega obiecte ascunse în alte structuri.

•Imposibilitatea administrării orale.

•Tehnologia de producere foarte costisitoare.

•Legarea reversibilă cu moleculele- țintă, ce duce la

necesitatea administrării concentrațiilor de anticorpi de
la 5000 până la 10000 de ori mai mari decât
concentrațiile structurilor țintă.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Clasificarea anticorpilor monoclonali.

MURINI HIMERICI UMANIZAȚI UMANI

100% proteine 33 % proteine 5 -10% proteine 100% proteine
murine murine murine umane

Condițiile principale pentru eficacitatea și siguranța

terapeutică a unui anticorp monoclonal sunt:
1. timpul de injumătățire biologică mare
2. imunogenitate scăzută pentru organismul uman
3. afinitate considerabilă față de antigen.

Himerici Umanizate Total umane

Murine

Micșorarea imunogenității anticorpilor monoclonali față de organismul

uman în funcție de tip (murine, himerici, umanizați, umani).
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
 În prezent în clinică și pe piața farmaceutică sunt prezente
aproximativ 300 de anticorpi monoclonali destinate pentru diferite
aplicații în tratament, diagnostic și prevenirea maladiilor.
Dintre acestea aproape 40% (114) sunt anticorpi monoclonali
umanizați, 34% (99) sunt complet umane și 10% (30) ocupă
anticorpi himerici.

Rata prezenței a diferitor clase de anticorpi monoclonali pe piața

farmaceutică.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

Exemple de anticorpi himerici aprobate: basiliximab (Simulect®),
cetuximab (Erbitux), infliximab (Remicade ®), precum și
rituximab (Rituxan®);

Exemple de anticorpi umanizați aprobate: alemtuzumab

(Campath®), Atlizumab (Actemra®), bevacizumab (Avastin ®),
daclizumab (Zanapax®), natalizumab (TYSABRI ®), omalizumab
(Xolair®), palivizumab (Synagis®), pertuzumab ( Omnitarg®), și
trastuzumab (Herceptin ®);

Exemple de anticorpi umani aprobate: adalimumab (Humira),

belimumab (Benlysta®), Denosumab (Prolia®), Ipilimumab
(Yervoy®), de ofatumumab (Arzerra®), panitumumab (Vectibix ®),
și ustekinumab (Stelara®);

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Reguli generale şi principii de bază în denumirea anticorpilor monoclonali.

În octombrie 2008 în cadrul OMS a fost reorganizată şi revocată grupa

de lucru a INN (International Nonproprietary Names) pentru a revizui şi
a simplifica sistemul de denumire actuală a anticorpilor monoclonali.

Ordinea de combinare a elementelor cheie în denumirea unui anticorp monoclonal este:

Sufixul –mab este utilizat pentru toţi anticorpii monoclonali cît şi pentru
fragmentele lor, şi provine din engleză mAb- Monoclonal Antibody.
Prefixul- este selectat ca punctul de pornire pentru crearea numelui unic a
AMC.
Target (ținta) - boala, celulă, infecţie ţintă. Este obligatoriu ca maladia
asupra căreia acţionează anticorpul monoclonal să fie încorporată în
denumirea lui.

Source spacies- sursa de obţinere- este un factor foarte important care

asigură siguranţă, deoarece unii anticorpi pot determina formarea
anticorpi- specifici preparatului întrodus.
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
 Infix Difeniție

-o- ACM murini

-xi- ACM himerici

-zu- ACM umanizați

-u- ACM umani

De exemplu, rituximab (Rituxan) a fost primul anticorp

monoclonal himeric aprobat în Statele Unite ale Americii.
Denumirea lui poate fi tradusă ca:
ri- prefix unic;
tu- tumoare;
xi- himeric;
mab- anticorp monoclonal;

Trastuzumab (HERCEPTIN)

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Producerea AMC
1. Imunizarea
animalului de laborator.
2. Izolarea celulelor de
limfocite tipă B din
splină.
3. Cultivarea celuleor
de milelom.
4. Fuziunea mielomului
cu limfocite tip B.
5. Separarea liniilor
celulare.
6. Screening.
7. Multiplicarea:
a- in vitro,
b- in vivo.
8. Recoltarea.
10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică
 Funcţia Anticorpilor Monoclonali
• O imunoglobulină este capabilă să se fixeze
pe antigenul care a provocat sinteza sa; ea
primeşte denumirea de anticorp.

• Imunoglobulinele neutralizează antigenele şi

le împiedică să se reproducă.

• Antigenele sunt distruse în continuare de

complement (sistem enzimatic) sau de către
celulele fagocitare (macrofage, limfocite T
etc.) care se fixează la rândul lor pe
imunoglobuline.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Posibile interacţiuni ale ACM cu celula tumorală
1 – AMC –despuiat (nud)

3 – ţintire în mai
multe trepte

2 – imunoconjugate

10.04.2018 Lector-Prof.univ. Eugen Diug Biofarmacie și farmacocinetică

 Mecanisme de acţiune ale ACM în cazul
cancerului
• Direct, prin stimularea sistemului imun
al gazdei, căruia “îi indică”
(semnalizează) ce celulă să atace;
• Blochează receptorii pentru factorii de
creştere;
• Acţionează ca purtător (vehicul) al unei
substanţe citotoxice, pe care o
ataşează direct pe ţintă – celula
malignă.
10.04.2018 Lector-Prof.univ. Eugen Diug Biofarmacie și farmacocinetică
 Lista anticorpilor monoclonali înregistrați în Repubica Moldova.
Denumirea Forma farm. Doza, Amb Nr Data Țara și firma
Denumirea componentului activ concentra- alaj înreg. Înteg. producător
comercială Utilizare ția
Mab Rituximab Concentrat pentru 100mg/10 10ml 18401 20.11.12 Roche
Thera® Leucemie limfocitară soluție perfuzabilă ml 50ml 18402 20.11.12 Registration
(himeric) cronică 500mg/50 Ltd.
Poliartrită ml (Marea
reumatoidală Britanie)
Egitumab® Trastuzumab Pulbere și solvent 440 mg N1+ 19892 11.10.13 Celltrion
(umanizat) Neoplasm mamar pentru soluție 20ml Healthcare Co.
Cancer gastric perfuzabilă Ltd (Coreea)
Actemra® Tocilizumab Concentrat pentru 20mg/ml 10ml 20060 20.11.13 Roche
(umanizat) Artrită reumatoidală soluție perfuzabilă 20ml 20061 Registration
4ml 20062 Ltd. (Marea
Britanie)
Avastin® Bevacizumab Concentrat pentru 100mg/4ml N1 16083 29.10.10 F.Hoffman- La
(umanizat) Cancer colonic soluție perfuzabilă 400mg/16 N1 16084 29.10.10 Roche Ltd.
și/sau rectal ml (Elveția)
Erbitux® Cetuximab.Cancer Soluție perfuzabilă 5mg/ml 100; 18170 19.09.12 Merck KGaA
(himeric) colorectal metastatic 20ml 18171 (Germania)
Flammegis Infliximab. Poliartită Liofilizat pentru 100mg N1 18724 23.01.13 Celltrion
® (himeric) reumatoidală concentrat pentru Healthcare Co.
Boala Crohn soluție perfuzabilă Ltd (Coreea)
Herceptin® Trastuzumab Pulbere pentru soluție 150mg N1 18400 20.11.12 Roche
(umanizat) Cancer de sân și perfuzabilă Registration
gastric Ltd. (MB)

10.04.2018
Denumirea Denumirea Forma farm. Doza, Ambalaj Nr Data Țara și firma
comercială componentului activ concentra- înreg. Înteg. producător
Utilizare ția

Lucentis® Ranibizumab Soluție 10mg/ml 0,25ml 1747 10.02.12 Novartis

(Recombinat Tulburări de vedere injectabilă N1 Pharma AG
umanizat) (Elveția)
Perjeta® Pertuzumab Concentrat 30mg/ml 14m 20336 24.02.15 Roche
(Recombinat Cancer mamar pentru soluție N1 Registration
umanizat) metastatic perfuzabilă Ltd.
(Marea
Britanie)
Prolia™ Donozumab Soluție 60mg/ml 1ml N1 18065 09.08.12 Amgenurope
60 mg Osteoporoză în injectabilă în 60mg/ml 1ml N1 17967 23.07.14 B.V. (Olanda)
(uman) menopauză Seringă flacon
preumplută
Sol.injectabilă
Synagis Palivizumab Pulbere și 100mg N1+1ml 16600 17.06.11 Abb Vie Bio-
(uman) Boli severe ale solvent pentru 50mg N1 16601 17.06.11 Pharma-
căilor respiratoare soluție Euticals
injectabilă GmbH
(Italia)
XgevaTM Denozumab Soluție 70mg/ml 1,7ml 20278 27.01.14 Amgen
Metastaze osoase injectabilă N1 Europe
(uman) B.V. (Olanda)

Xolair® Omalizumab Pulbere și 150mg N1 20486 21.01.14 Novartis

(umanizat) Controlul astmului soluție pentru 75mg N1 20487 21.01.14 Pharma AG
bronșic Soluție (Elveția)
injectabilă

10.04.2018
 Mab Thera®- Rituximab
este un anticorp monoclonal himeric
uman/şoarece, produs prin inginerie
genetică ce reprezintă o imunoglobulină
glicozilată, cu regiuni constante de IgG1
uman şi cu secvenţe regionale variabile
de lanţuri murine uşoare şi grele.
Anticorpul este produs în cultură de
suspensie de celule de mamifer (ovar de
hamster chinezesc) şi purificat prin
cromatografie de afinitate şi schimb de
ioni, incluzând procedee specifice de UTILIZARE
inactivare virală şi îndepărtare.
• Mecanismul de acțiune. Anticorpul se
leagă specific de un epitop distinct ce 1. Limfom non-Hodgkin;
conține ambele domenii extracelulare (cu 2. Leucemie limfocitară
greutate moleculară mică și cu greutate cronică;
moleculară mare) ale moleculei CD20. 3. Poliartrită reumatoidă;
Molecula CD20 este o fosfoproteină
transmembranară exprimată pe suprafața 4. Granulomatoză cu
limfocitelor B din stadiul de pre-B până la poliangeită şi
stadiul limfocitelor B mature și pe celulele poliangeită
B tumorale. microscopică.

10.04.2018
 Ținte pentru anticorpi monoclonali

CD20 este ţinta pentru anticorpi monoclonali (MAB)

rituximab , ibritumomab tiuxetan și tositumomab ,
care sunt toți agenții activi în tratamentul tuturor
celulelor B limfoame și leucemii .
Anti-CD20 mAb Ofatumumab ( Genmab ) a fost
aprobat de FDA in octombrie 2009 pentru tratarea
leucemiei limfocitare cronice .
CD20 este antigenul limfocitelor de tip B -
reprezentând o fosfoproteină activat-
glicozilată atașată pe suprafața tuturor
celulelor B care încep formarea lor la faza
pro-B și creșterea progresivă până la
maturitate.
La om CD20 este codificată de gena
MS4A1

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Ținte pentru anticorpi monoclonali

HER2 (receptorul pentru factorul de

creștere epidermal 2), de asemenea,
cunoscut sub numele de Neu, ErbB-2,
CD340 (cluster de diferențiere 340) sau
p185, este o proteină care la om este
codificat de gena ERBB2.
HER2 este un component al receptorului
factorului de creștere (EGFR / ErbB)
epidermal.
Amplificarea sau supra-expresia acestei
gene sa dovedit a juca un rol important în
dezvoltarea și progresia de anumite tipuri
agresive de cancer de sân.
În ultimii ani, proteina a devenit un
biomarker important și țintă de tratament
pentru aprox. 30% dintre paciente cu
cancer de sân.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 Mecanisme de acţiune ale preparatului Rituximab
ADCC (antibody-dependent cell-
mediated cytotoxicity): ADCC
(citotoxicitate dependentă de anticorpi
celulari): celule naturale ucigase, celulele
T, atașate de AMC și macrofagii recunosc
și ucid anticorpii ca celule țintă, ceea ce
duce la liza celulelor
CDC (citotoxicitate dependentă
de complement): Legarea
specifică ACM de membrana
celulei și traversarea prin
canale, ca rezultat Retuxanul
pătrunde în celulă și produce
liza acestora.

Apoptosis: Legarea AMC de

celule care semnalizează
distrugerea lor.

10.04.2018 Lector-Prof.univ. Eugen Diug Biofarmacie și farmacocinetică

 Cetuximab (Erbitux) este inhibitor al receptorului factorului de crestere
epidermică (RFCE) utilizat pentru tratamentul cancerului colorectal
metastatic și a cancerului capului si gatului. Cetuximab este un
anticorp monoclonal himeric (șoarece/om) administrat prin perfuzie
intravenoasă, care este fabricat și distribuit în Statele Unite de către
companiile farmaceutice Bristol-Myers Squibb și Eli Lilly and Company
și în Europa de către compania de medicamente Merck KGaA.

10.04.2018 Biofarmacie și farmacocinetică

 IMUNOTERAPIE

Radioizotop Herceptin
Factor de Herceptin
Anticorp crestere blocheaza
receptorul

Antigen

Celula
tumorala
mamara

Distrugerea
celulei tumorale

Cresterea se opreste
10.04.2018