LABORATOR - ORGANIZARE

• -zona nesterilă – zona de preparare a mediilor, zona pentru sterilizarea

sticlăriei şi a mediilor de cultură - etuva + autoclav, camera de vegetatie,
camera de aclimatizare.
• -zona sterilă – este constituită dintr-o cameră sau incintă sterilă.

• Contaminarea poate duce la pierderi de la 1% pînă la 50%.

• Având în vedere valoarea plantelor multiplicate in vitro nu pot fi acceptabile
pierderi mai mari de 1%.
• Sistemul de încălzire trebuie să permită realizarea unor temperaturi
constante mai ales pe timpul iernii (min. 25°C), iar pe timpul verii este
necesar utilizarea unui sistem de ventilaţie pentru controlul temperaturilor
prea ridicate.
Camera de vegetatie
•Camera de vegetaţie este locul unde se păstreză materialul vegetal (plante, calus,
suspensii, protoplaşti) în vasele de cultură în intervalul dintre două subculturi. Elementele
caracteristice pentru această încăpere sunt definite de temperatură, umiditatea relativă,
sistemul de iluminare şi tipul de rafturi pentru culturi.

•Elementul esenţial în camera de vegetaţie îl reprezintă temperatura. În funcţie de aceasta se

stabilesc şi alţi parametrii cum sunt lumina, umiditatea relativă şi tipurile de rafturi (simple, cu
oglindă sau cu sistem de răcire) pentru vasele de cultură.
•Valoarea medie a temperaturii în camera de vegetaţie este cuprinsă între 22 şi 25 ºC.
Încălzirea camerelor de vegetaţie nu prezintă o problemă în sine; mult mai dificil este însă
răcirea şi menţinerea unei temperature constante – aceasta se realizează prin instalarea
sistemelor de aer condiţionat sau a unor ventilatoare.

• Nu este indicat apelarea la geamuri pentru camerele de vegetaţie deoarece aceasta ar

spori riscul contaminării culturilor în timpul verii şi ar crea variaţii de umiditate în
timpul iernii.
• Camerele de vegetaţie sunt prevăzute cu sisteme de iluminat neincandescent:
majoritatea culturilor se practică sub lumină florescentă albă.
• Stadiul de dezvoltare a culturii poate necesita însă utilizarea unui spectru variat de
lumină.
• Culturile pot manifesta cerinţe specifice şi faţă de fotoperioadă astfel încât orice
cameră de vegetaţie va fi dotată cu un sistem automat pentru programarea
fotoperioadei.
• Utilizarea unor surse de lumină de tipul reflectoarelor este limitată deoarece căldura
generată de acestea poate determina condensarea sau concentrarea mediilor de
cultură.
• Umiditatea relativă este foarte greu de controlat în interiorul vaselor de cultură.
Valoarea umidităţii relative în camera de vegetaţie nu trebuie să scadă sub 50 %;
dacă valoarea creşte peste limitele acceptabile se vor folosi metode de uscare iar
pentru situaţia inversă vor fi folosite cantităţi mai reduse de agar la prepararea
mediului.
• Zona sterilă

• - se execută repartizarea mediului de cultură precum şi prelevarea, sterilizarea şi

inocularea explantelor sau subcultivarea materialului biologic crescut in vitro - HOTA
cu flux de aer steril

• - să fie cât mai izolată de restul încăperilor din zona nesterilă pentru a
preîntâmpina vehicularea germenilor;

• -trebuie să fie prevăzută cu instalaţii de gaz, curent electric, dar fără apă curentă şi
canalizare;
• -două tipuri de hote – cu flux de aer orizontal şi flux de aer vertical, ambele fiind
dotate cu baterii de filtre ce permit reţinerea particulelor mai mari de 0,2 micrometri;
ele trebuie să permită lucrul a două persoane concomitent; cele mai folosite sunt
hotele cu flux de aer orizontal;
• -hota cu flux de aer steril trebuie să posede sistem propriu de iluminare şi
posibilitatea ataşării a 1-2 becuri de gaz;
• - înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20 minute hota se porneşte pentru a
se realiza sterilizarea incintei de lucru; în acelaşi timp se pune în funcţiune
lampa UV şi se pulverizează alcool în interiorul hotei;
• - scaune rotative pentru personalul care lucrează la hotă, dulapuri pentru sticlăria
sterilă, cuptor cu microunde, măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii şi a celorlalte
materiale folosite în perioada de lucru;
• -înainte de începerea lucrului personalul se va spăla pe mâini în antecameră, iar
în camera sterilă se va clăti cu alcool şi va purta echipamentul specific: halat
alb, boneta şi mască pe figură.

• Pentru menţinerea gradului de steril camera este prevăzută cu un sistem de

ultraviolete, lumina UV fiind însă utilizată, înainte sau între perioadele de
inoculare şi doar când personalul şi materialul biologic nu se află în încăpere.
Pentru o protecţie sporită a personalului, este indicat să fie avertizată prezenţa
şi funcţionarea UV-ului iar închiderea/deschiderea lămpilor UV să fie
practicabile din exteriorul camerei.
 Dotările necesare într-un laborator de culturi in vitro
Sticlăria
•toate tipurile de recipiente de sticlă, folosite într-un laborator de chimie-biologie. Este
bine ca vasele să fie din sticlă termorezistentă de tip Pyrex sau din silicat de bor.
• pipete, cilindri gradaţi, baloane cotate, pahare Berzelius, pahare Erlenmayer, pâlnii,
vase Petri, sticle şi borcane pentru reactivi.

•orice recipient nou din sticlă eliberează, cu ocazia primei utilizări, compuşi toxici
în mediul de cultură. Se recomandă ca sticlăria nouă să fie spălată cu apă şi
detergent şi apoi limpezită, după care se umple cu apă bidistilată şi se
autoclavează de 2-3 ori câte 30 minute. După această operaţiune se poate utiliza în
inoculări.
• IDEAL - vase speciale din material plastic autoclavabile şi cutii Petri din material
plastic de unică folosinţă, care sunt livrate steril.

Aparatura şi dispozitivele
• -hota cu flux de aer steril;
• -autoclav;
• -aparat de distilat şi bidistilat apa;
• -frigidere de mare capacitate;
• -agitatoare magnetice;
• -balanţe analitice şi tehnice;
• -pH-metru;
• -etuve;
• -microscoape şi lupe binoculare;
• -centrifugă;
• -aparat pentru repartizarea mediului de cultură;
• -aparat de fotografiat.
 Instrumentar
• instrumentar de tip chirurgical:
•-pense de diferite forme şi mărimi;
•-foarfeci;
•-bisturie, cuţite, lame de ras;
•-ace, anse, seringi.

Substanţe necesare
•-compuşi organici;
•-reactivi de uz comun;
•-substanţe indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal;
•-alte materiale chimice: detergenţi, săpunuri, praf de curăţat, alcool, amestec
cromic.
Descriere produs Utilizare produs
sticlărie
Vase de cultură din sticlă, autoclavabile, cu posibilitate de inchidere ermetică Veselă pentru menţinerea materialului vegetal prin subculturi

Capace pentru vasele de cultură, autoclavabile, cel mai indicat din polipropilenă Închiderea ermetică a vaselor de cultură
Cutii Petri sau plăci de faianţă autoclavabile Suprafaţă sterilă pentru fasonarea explantelor în timpul transferului pe mediu
proaspăt
Sticle cu capac pentru apă, autoclavabile (500 mL) Apă sterilă pentru clătire
Vas Erlenmeyer, 1000 mL
Pregătirea mediului/soluţii
Vas Erlenmeyer, 2000 mL
Vas Erlenmeyer, 4000 mL Pregătirea mediului/soluţii
Vas Erlenmeyer, 6000 mL Pregătirea mediului/soluţii
Sistem de filtrare cu pompă de vacuum, pentru lichide, din polistiren; 200 mL; 47 mm în diametru/
membrane filtrante de nailon cu pori de 0,22 µm Pregătirea mediului/soluţii
Cilindru de sticlă/plastic gradat; 10 mL Sterilizarea soluţiilor stoc fierbinţi
Cilindru de sticlă/plastic gradat; 100 mL
Cilindru de sticlă/plastic gradat; 1000 mL Preparare soluţii stoc
Pipete gradate, 1 mL, sterile sau autoclavabile
Pipete gradate, 5 mL, sterile sau autoclavabile Preparare soluţii stoc
Pipete gradate, 10 mL, sterile sau autoclavabile Preparare soluţii stoc
Pipete gradate, 25 mL, sterile sau autoclavabile
Măsurare soluţii stoc
eprubete
Măsurare soluţii stoc
Măsurare soluţii stoc
Măsurare soluţii stoc
Iniţierea culturii
echipamente
Sistem de purificare a apei; apa trebuie să aibă o rezistenţă de cel puţin 200.000 ohms/cm Purificarea apei pentru mediul de cultură
Balanţă electronică (cu trei zecimale, max.200 g capacitate) Cântărirea substanţelor chimice
pH-metru (scara 0-14±0,01; conversie automată în funcţie de temperatură (0-60ºC), cu 1-2 valori Măsurarea şi corectarea valorii pH a soluţiilor
de calibrare
Plită electrică cu agitator magnetic; valoarea de încălzire până la 400 ºC; viteză variabilă de agitare Amestecarea şi încălzirea mediului de cultură /soluţii stoc
(50-150 rpm); rezistentă chimic

Combină frigorifică pentru temperaturi de 2-6ºC în frigider şi respectiv, -20ºC în congelator Păstrarea soluţiilor stoc, mediilor, hormonilor, substanţelor chimice

Autoclav cu operare la 121ºC, cu control presiune şi durată Sterilizarea mediilor, soluţiilor, sticlăriei, instrumentarului

Oală sub presiune cu operare între 116-126 ºC; 10-20 psi Sterilizarea volumelor mici de mediu, soluţii, obiecte mici
Etuvă 120V (S636) sau 240V (S637) Presterilizare, sterilizare uscată
Cronometru electronic, cu alarmă Alarmă şi cronometrare
Menţinerea culturilor

•În general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent
alb cu o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 lucşi) la o temperatură de 20-
25°C şi un fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric.
•Odată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor, care se văd
în general după câteva zile.
Infecţiile şi cauzele apariţiei acestora

•Apariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze.

•După simptomele manifestate putem să ne dăm seama dacă
infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie.
•Dacă este generată de o ciupercă, se va observa dezvoltarea
unui miceliu cu o textură mată sau pufoasă, de cele mai multe
ori de culoare albă sau gri. Penicillium generează un miceliu
de culoare gri mat, pe când Rhizopus nigricans, care se şi
multiplică foarte repede şi care trebuie distrus prin
autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare, sau
aruncare, formează miceliu de culoare închisă cu aspectul
unor fructificaţii de culoare neagră.
•Dacă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de
forma unei paste lăptoase în interiorul mediului şi pe suprafaţa
acestuia. Această pastă este uneori colorată roz sau galben.
•Manipularea necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor de
cultură in vitro, generând infecţii ale culturilor se poate datora: vorbitului în timpul lucrului la
hota cu flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a
instrumentarului, transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele
neinfectate.
CLZ - OBIECTIVE
• alegerea mediilor de cultură și a tipului de explant adecvate pentru
obținerea unei rate de micropropagare ridicată,
• stabilirea compoziției mediilor de cultură, a tipului de hormoni și a
concentrațiilor acestora,care să favorizeze obținerea de neoplantule,
creșterea și proliferarea lăstarilor in vitro,
• stabilirea compoziției mediilor de cultură, a tipului de hormoni și a
concentrațiilor acestora, care să favorizeze înrădăcinarea in vitro a
microlăstarilor,
• determinarea capacității de aclimatizare a vitroplantelor, după faza de
înrădăcinare in vitro