1 0 0

Transportul prin membrana plasmatica

Membrana plasmatica asigura homeostazia celulara Bistratul lipidic lipsit de proteine este in principiu impermeabil pentru moleculele hidrosolubile. Mai precis, intr-un timp suficient de lung, orice molecula poate difuza prin bistratul lipidic de-alungul gradientului de concentratie al acesteia dar timpul necesar pentru moleculele polare sau incarcate electric (nehidrofobe) este inoperant de lung. Reactiile celulare necesita insa materie prima din exerior iar produsele secundare trebuie eliminate. Celula trebuie sa schimbe continuu, in timp util, substante cu mediul extern. Membrana celulara controleaza intrarile si iesirile din celula, asigurind homeostazia celulara (homeo=acelasi, stasis=stare). Membranele celulare au doua functii majore: pe de o parte constituie bariere in jurul celulei sau organitului, pe de alta parte, controleaza trecerea substantelor inspre si dinspre zona pe care o inchid. Se stie astazi ca substantele traverseaza barierele biologice numai in trei moduri distincte: 1/ unele trec direct prin membrana (difuzeaza) 2/ altele sunt transportate de proteinele membranare 3/ o a treia categorie este transportata prin intermediul unei vezicule formate de o parte a membranei. Transportul conform unor gradienti de concentratie, ce nu necesita un aport de energie metabolica celulara, este transportul pasiv. Transportul activ, impotriva gradientilor de concentratie, are loc cu consum de energie celulara. Interiorul hidrofobic al membranei face ca aceasta sa fie relativ impermeabila pentru ioni si multe din moleculele polare. In consecinta, membrana plasmatica impiedica pierderea majoritatii produselor sale interne solubile in apa. Totusi, molecule mici neincarcate se pot strecura printre capetele hidrofile ale fosfolipidelor si strabate bistratul. Moleculele mici, neincarcate intra sau parasesc celula prin difuzie, de-alungul gradientului lor de concentratie. Aceste molecule se dizolva in bistratul lipidic pe o parte a membranei, iesind pe partea opusa a acestuia. Viteza cu care o substanta difuzeaza prin bistratul lipidic depinde de solubilitatea ei in lipide si de dimensiunea ei moleculara. Moleculele mici, nepolare, ca O2 si N2 traverseaza rapid bistratul lipidic. Moleculele polare neincarcate traverseaza desemenea rapid bistratul lipidic daca sunt suficient de mici. De exemplu CO2 (44 D), etanolul (46 D) si ureea (60 D) trec rapid. Glicerolul (anti-freeze, 92 D) care este deasemenea neincarcat dar mai mare, trece mult mai incet iar glucoza (180 D), avind o dimensiune dubla fata de glicerol, traverseza bistratul lipidic foarte anevoios (Fig.1). Apa este relativ insolubila in lipide. Este surprinzator astfel ca moleculele de apa traverseaza bistratul lipidic foarte rapid. Aceasta s-ar explica, in parte, prin faptul ca molecula de apa este mica si neincarcata si, in parte, prin structura dipolara unica a moleculei de apa care ii permite sa treaca foarte usor prin straturile externe hidrofilice ale membranei. In consecinta, bistraturile lipidice sunt de un bilion (109) de ori mai permeabile pentru moleculele de apa decit pentru ionii incarcati, chiar daca acestia sunt mici, precum Na+ si K+ (Fig.2). Imposibilitatea ionilor de a penetra membrana plasmatica se datoreaza sarcinii lor electrice dar si faptului ca, in solutie, ionii sunt inconjurati de un strat de molecule de apa care le creste mult dimensiunile.

Proteine transportoare Multe molecule traverseaza rapid membranele biologice chiar daca nu sunt foarte solubile in lipide. Ca exemple se pot da diferiti ioni mici, glucoza si aminoacizii. Aceste substante sunt transportate de proteinele membranare transportoare. Fiecare proteina transportoare este specifica, ducind cu ea numai una sau citeva substante similare din punct de vedere chimic. Prezentam mai jos cele mai importante tipuri de sisteme proteice transportoare. a/Proteinele-canal In acest caz proteinele constituie canale prin bistratul lipidic. Prin aceste canale, moleculele solubile in apa pot traversa membrana prin simpla difuzie, evitind miezul hidrofob al membranei. In timp ce unele canale sunt deschise tot timpul, altele se comporta ca si cum ar avea porti ce se deschid si se inchid. Canalele cu porti permit ca permeabilitatea membranei sa se schimbe din timp in timp. Aceasta proprietate este vitala, printre altele, in cazul celulelor musculare si nervoase. b/Difuzia facilitata In difuzia facilitata, o proteina transportoare se combina cu o substanta specifica si o muta dintr-o parte a membranei in alta, de-alungul gradientului ei de concentrtie. Aceasta determina cresterea efectiva a permebilitatii membranare pentru substanta respectiva care o traverseaza cu o viteza mai mare decit ar face-o in lipsa transportorului. Un exemplu il constituie sistemul ce accelereaza difuzia glucozei in celulele unor tesuturi. In ficat, cristalin si globulele rosii , difuzia facilitata misca glucoza in ambele directii ale membranei plasmatice prin intermediul unei proteine carause. Molecula carausa sesizeaza si preia glucoza de pe partea membranei unde este mai multa glucoza. Cind celula foloseste glucoza rapid si concentratia acesteia in interiorul celulei scade, molecula carausa preia si transporta glucoza din exteriorul celulei unde e mai multa glucoza, spre interior, cu o viteza mai mare decit in directie opusa. Difuzia facilitata este la fel de importanta in cresterea vitezei cu care glucoza paraseste celula. Celulele hepatice, de exemplu, indeparteaza glucoza din singe cind nivelul glucozei in singe creste, realizind si operatia inversa cind nivelul glucozei in singe scade. Transportul activ Toate proteinele canal si majoritatea proteinelor transportoare permit transportul pasiv (sau difuzia facilitata) al substantelor conform gradientului lor de concentratie. Daca molecula transportata este neutra, doar diferenta de concentratie de pe cele doua fete ale membranei (gradientul ei de concentratie) este cea care determina transportul pasiv si directia acestuia. Daca molecula este incarcata electric, transportul ei este influientat atit de gradientul de concentratie cit si de diferenta de potential intre fetele membranei (potentialul de membrana). Gradientul de concentratie si gradientul electric se pot combina pentru a se calcula forta motoare neta, respectiv gradientul electrochimic pentru fiecare substanta dizolvata incarcata electric. Se stie ca toate membranele plasmatice prezinta o diferenta de potential electric intre cele doua fete, partea citoplasmatica fiind, de regula, negativa fata de partea externa. Aceasta diferenta de potential favorizeaza intrarea in celula a ionilor incarcati pozitiv, dar se opune intrarii ionilor incarcati negativ. Astfel potentialul de repaos al celulei favorizeaza intrarea Na+ si se opune iesirii K+. Celula are nevoie, deasemenea, si de proteine transportoare care sa pompeze activ anumite substante prin membrana impotriva gradientului de concentratie; acest proces, cunoscut sub denumirea de transport activ, este intotdeauna mediat de proteine transportoare (Fig.3). Transportul activ de catre proteina transportoare este intotdeauna directionat deoarece este strins cuplat la o sursa de energie metabolica, cum ar fi hidroliza ATP sau un gradient ionic. Prin urmare,

transportul mediat de proteinele transportoare poate fi activ sau pasiv (difuzie facilitata) in timp ce transportul prin proteinele canal este intotdeauna pasiv.

Transportul activ si proteinele transportoare Unele proteine carause transporta o singura substanta de pe o parte pe alta a membranei cu o viteza determinata de constantele ei Vmax si KM. Acestea sunt proteinele transportoare uniporteri. Altele, cu o cinetica mai complexa, functioneaza ca transportori cuplati, in care transferul unei substante depinde de transferul simultan sau secvential al unei alte substante, fie in aceeasi directie (simport), fie in directie opusa (antiport) (Fig.4). De exemplu, majoritatea celulelor animale preia glucoza din fluidul extracelular, unde concentratia acesteia este mai mare in raport cu cea din citosol, prin transport pasiv, prin intermediul transportorilor de glucoza ce functioneaza ca uniporteri. Exista o varietate de asemenea transportori de glucoza, toti apartinind aceleasi familii de proteine omoloage ce contin 12 -helixuri transmembranare. Spre deosebire de acestea, celulele intestinale si renale preiau glucoza din lumenul intestinal si respectiv, din tubulii renali, unde concentratia de zahar este scazuta. Aceste celule transporta activ glucoza prin membrana lor plasmatica prin simport cu Na+. Un alt exemplu este cel al proteinei banda 3, care actioneaza in eritrocitul uman ca transportor anionic, operind ca antiporter pentru schimbul Cl- contra HCO3. Desi detaliile moleculare nu se cunosc, se presupune ca proteinele de transport transfera substantele prin bistratul lipidic prin intermediul unor transformari conformationale reversibile care fac ca locurile de legare ale moleculei transportate sa fie expuse alternativ intii pe o parte, apoi pe cealalta parte a membranei (Fig.5). Intrucit se stie astazi ca proteinele transportoare sunt proteine transmembranare multipass, este foarte putin probabil ca ele sa se roteasca in interiorul bistratului sau sa se deplaseze intr-un dute-vino, cum se credea in trecut. Procesul prin care o proteina carausa transfera moleculele dizolvate prin bistratul lipidic se aseamana foarte mult cu reactia enzima-substrat iar proteinele transportoare se comporta ca niste enzime asociate membranei. Fiecare tip de proteina carausa are unul sau mai multe locuri specifice de legare pentru substanta transportata (substratul). Cind transportorul este saturat (adica toate aceste locuri de legare sunt ocupate), viteza de transport este maxima. Aceasta viteza, Vmax, este specifica fiecarui transportor. In plus, fiecare transportor este caracterizat de o constanta de legare a substantei pe care o transporta; KM este egala cu concentratia substantei transportate atunci cind viteza de transport este din valoarea maxima (Fig.6). Ca si in cazul enzimelor, legarea substantei transportate poate fi blocata de inhibitori competitivi (ce concureaza pentru acelasi loc de legare dar pot fi transportati sau nu de proteina respectiva) si inhibitori necompetitivi (ce se leaga de alte locuri dar altereaza specific structura carausului). Spre deosebire de reactiile enzima-substrat, substanta transportata nu este, de regula, modificata prin legarea covalenta la proteina transportoare. In cele ce urmeaza, transportul activ va fi ilustrat printr-un exemplu de proteina tansportoare ce joaca un rol crucial in generarea si mentinerea gradientilor de Na+ si K+ prin membrana plasmatica a majoritatii celulelor animale. Pompa Na+-K+ din membrana plasmatica Concentratia K+ intracelular este, de regula, de 10 pina la 20 de ori mai mare decit in afara celulei, in timp ce situatia este inversa pentru ionul de Na+. Aceste diferente de concentratie sunt mentinute de pompa Na+-K+, pe care o gasim in membrana plasmatica a tuturor celulelor animale.

4 Pompa opereaza ca antiporter, pompind Na+in afara celulei si K+ spre interiorul celulei, impotriva gradientului lor de concentratie (Fig.7). Gradientul de Na+ produs de pompa regleaza volumul celulei prin efectele sale osmotice si este folosit pentru facilitarea transportului zaharurilor si aminoacizilor in interiorul celulei. Aproximativ 1/3 din necesarul de energie al unei celule animale este consumat pentru sustinerea activitatii acestei pompe. In cazul celulelor nervoase electric active, in care se produc scurgeri repetate de Na+ si K+ (dictate de gradientii de concentratie) in cursul propagarii impulsului nervos, consumul de energie pentru aceasta pompa atinge 2/3 din necesarul celular de energie. Trei ioni de Na sunt pompati in afara pentru doi ioni de K pompati spre interior. Un progres in intelegerea functionarii pompei Na+-K+ a intervenit in 1957, odata cu descoperirea enzimei care hidrolizeaza ATP in ADP si monofosfat (ATP-aza) si care necesita prezenta Na+si K+ pentru activitate optima. S-a observat deasemenea ca ouabaina, cunoscuta ca inhibitor al pompei Na+-K+, inhiba si ATP-aza. Datele cruciale care au demonstrat ca energia pentru activitatea pompei provine din hidroliza ATP au fost furnizate de studii pe fantome eritrocitare resigilate, in care se putea varia concentratia ionilor , a ATP si a diferitelor substante pe ambele parti ale membranei, stabilindu-se ca: 1/ transportul Na+si K+ este strins legat de hidroliza ATP, astfel incit un proces nu se poate desfasura in lipsa celuilalt. 2/ transportul ionic si hidroliza ATP au loc numai cind Na+si ATP sunt prezente in interiorul fantomei iar K+ este prezent in exteriorul ei. 3/ ouabaina actioneaza ca inhibitor numai cind se afla in exteriorul fatomei, fiind in competitie pentru locul de legare al K+. 4/ pentru fiecare molecula hidrolizata de ATP sunt pompati trei ioni de Na in afara si doi ioni de K spre interior (in fiecare secunda o molecula de ATPaza poate hidroliza 100 de molecule de ATP). Cit priveste modul de cuplare al hidrolizei ATP la transportul ionic, acest lucru nu s-a lamurit decit in masura in care s-a stabilit ca , in cursul ciclului de pompare, gruparea fosfat terminala a ATP este transferata catre un rest de acid aspartic al ATP-asei, de unde este dislocat ulterior (Fig.8). Pompa Na+-K+ din fantomele eritrocitare poate fi facuta sa produca ATP. Daca gradientii de Na+si K+ sunt crescuti experimental la valori la care energia electrochimica pe care o stocheaza depaseste energia chimica de hidroliza a ATP, ionii respectivi se deplaseaza conform gradientului lor de concentratie si Na+-K+ ATPaza sintetizeaza ATP din ADP si monofosfat. Na+-K+ ATPaza a fost izolata si purificata. Ea consta dintr-o proteina mare transmembranara multipass, ce contine cca 1000 de aminoacizi si o glicoproteina asociata mai mica, single pass. Proteina multipass are locuri de legare pentru Na+ si ATP pe fata ei citoplasmatica si un loc de legare pentru K+ pe fata ei externa. Pentru izolare, ATP-aza se solubilizeaza in detergent, se purifica si se amesteca cu fosfolipidele adecvate (Fig.9). La indepartarea detergentului, se formeaza vezicule membranare ce contin pompa Na+-K+ reconstituita, pompind Na+si K+ in prezenta ATP. ATP aza Na+-K+ este necesara pentru mentinerea echilibrului osmotic si stabilizarea volumului celular Fiind electrogena (pompeaza 3 ioni de Na+ in afara contra 2 ioni de K+ inspre interior), ATPaza Na+K+ genereaza un curent electric net producind o diferenta de potential intre interiorul negativ al celulei fata de exeriorul pozitiv. Acest efect al pompei contribuie totusi doar maximum 10% la potentialul de membrana al celulei. ATPaza Na+-K+ are insa un rol direct si important in reglarea volumului celular. Celulele contin o concentratie mare de molecule dizolvate, printre care molecule organice incarcate negativ ce nu pot parasi celula (anioni ficsi) si cationii ce le insotesc, pentru a le echilibra sarcina. Se creeaza astfel un

5 gradient osmotic puternic ce tinde sa atraga apa in celula. In cazul celulelor animale acest efect este anihilat de un gradient osmotic opus datorat unei concentratii inalte de ioni anorganici - in special Na+ si Cl- in fluidul extracelular. ATPaza Na+-K+ mentine echilibrul osmotic prin pomparea in afara a Na+ ce se mai scurge in celula datorita diferentei mari de concentratie; Cl- este mentinut in afara datorita potentialului de membrana. Importanta ATPazei Na+-K+ pentru controlul volumului celular este indicata de observatia ca multe celule animale se umfla si uneori crapa daca sunt tratate cu ouabaina, care inhiba ATPaza Na+-K+. De aceea, pentru majoritatea celulelor animale, activitatea ATPazei Na+-K+ este esentiala (fig.1). Si pompa de Ca2+ este o ATPaza asociata membranei Celulele eucariote mentin o concentratie foarte scazuta de Ca2+ in citosol ( 10-7M) comparativ cu o concentratie extracelulara mult mai ridicata (10-3M). In aceste conditii, chiar un influx foarte mic de Ca2+ creste semnificativ concentratia Ca2+ liber in citosol. De aceea una din metodele celulei de a transmite rapid semnale extracelulare prin membrana este influxul de Ca2+ ca raspuns la aceste semnale. Mentinerea unui gradient semnificativ de Ca2+ este astfel foarte importanta pentru celula. Acest lucru se realizeaza printr-o pompa de Ca2+ (o ATP-aza) ce pompeaza activ Ca2+ spre exteriorul celulei, precum si prin alte mecanisme. Cea mai bine studiata pompa de Ca2+ este ATPaza legata de membrana reticolului sarcoplasmic (RS) al celulelor musculare. O forma specializata a reticolului endoplasmic, reticolul sarcoplasmic, formeaza o retea de vezicule tubulare ce stocheaza Ca2+ in citoplasma celulelor musculare. Cind celula musculara este depolarizata, Ca2+ se elibereaza in spatiul citoplasmatic, determinind contractia muschiului. Pompa de Ca2+ constituie 90% din proteina RS si raspunde de pomparea activa a Ca2+ din citosol in RS. Reticolul endoplasmic al celulelor nemusculare contine o Ca2+-ATPaza similara dar fiind in cantitati mai mici, aceasta a fost greu de izolat si purificat. Ca2+-ATPaza poate fi analizata biochimic prin aceleasi procedee ca si ATPaza Na+-K+, constatindu-se ca functioneaza in acelasi mod. Studiile de secventializare a ADN au demonstrat ca ATPaza Na+-K+ si Ca2+-ATPaza sunt proteine omoloage. Subunitatile catalitice mari ale fiecareia din cele doua ATPaze au multiple izoforme; se presupune ca acestea se constituie din -helixuri transmembranare si sunt fosforilate si defosforilate in cursul ciclului de pompare. Transportul activ poate folosi energia gradientilor ionici Multe sisteme de transport activ folosesc energia stocata in gradientii ionici in locul celei provenite din hidroliza ATP. Energia libera degajata in cursul miscarii unui ion conform gradientului sau de concentratie este folosita ca forta motoare pentru a trage alte substante dizolvate la deal, impotriva gradientului lor de concentratie. Deaceea proteinele transportoare respective functioneaza ca transportori cuplati - simporteri sau antiporteri. In membrana plasmatica a celulelor animale, Na+ este de obicei ionul cotransportat, gradientul sau electrochimic generind forta motoare pentru transportul activ al celei de-a doua molecule. Celulele epiteliale intestinale si renale, de exemplu, contin o multitudine de sisteme simport in care forta motoare este asigurata de gradientul de Na+ prin membrana plasmatica; fiecare sistem importa in mod specific in celula un mic grup de zaharururi si aminoacizi inruditi. In acesti transportori, Na+ se leaga specific pe diferitele situsuri ale proteinei transportoare; intrucit Na+ tinde sa fie atras in celula conform gradientului sau electrochimic, zaharul sau amonoacidul sunt tiritiimpreuna cu acesta in celula. Cu cit este mai mare gradientul electrochimic pentru

6 Na+, cu atit este mai mare viteza de intrare a substantei respective si invers, transportul substantei scade atunci cind concentratia Na+ in fluidul extracelular descreste. Distributia asimetrica a proteinelor de transport in celulele epiteliale asigura transportul transcelular al substantelor In celulele epiteliale, cum sunt cele implicate in absorbtia nutrientilor din intestin, proteinele transportoare sunt distibuite asimetric in membrana plasmatica, contribuind astfel la transportul transcelular al substantelor absorbite. Dupa cum se observa in figura 3, simporterii dependenti de Na+ situati in zona apicala (absorbanta) a membranei plasmatice, transporta activ nutrientii in celula, generind gradienti substantiali de concentratie, in timp ce proteine transportoare independente de Na+ situate in zona bazala si laterala (bazolaterala) permit nutrientilor sa paraseasca celula in mod pasiv in acord cu gradientii lor de concentratie. N+-K+ ATPaza ce mentine gradientul transmembranar al Na+ prin membrana plasmatica a acestor celule este localizata in zona bazolaterala. Se presupune ca mecanisme similare sunt folosite de celulele epiteliale intestinale si renale pentru pomparea apei dintr-un spatiu extracelular in altul. In multe din celulele epiteliale suprafata membranei plasmatice este mult crescuta prin formarea a mii de microvili ce reprezinta extensii subtiri si lungi ale suprafetei apicale a celulelor (fig. 3). Microvilii cresc aria totala de absorbtie a celulei de pina la 25 de ori, crescind astfel substantial capacitatea de transport a celulei. In bacterii si drojdii precum si in multe organite ale celulelor animale, majoritatea sistemelor de transport alimentate de gradientii ionici depind mai degraba de gradientii de H+ decit de cei de Na+, ceea ce reflecta predominanta H+- ATPazei si absenta virtuala a N+-K+ ATPazei in aceste membrane. Transportul particolelor si moleculelor mari. Endo-si exocitoza Datorita fluiditatii sale, membrana celulara poate sa-si schimbe forma, constituind invaginatii ce inchid particolele externe. Pseudopodele formate pentru a include particola fuzioneaza si formeaza o vezicula inclusa de celula. Aceasta se desprinde apoi de membrana celulara, raminind in interiorul celulei (Fig.10). Tehnica ADN-ului recombinant in studiul proteinelor de transport Deoarece obtinerea cristalelor tridimensionale ale proteinelor multipass pentru studii cristalografice cu raze X este dificila, structura tridimensionala a proteinelor de transport nu se cunoaste. Prin urmare, nu se cunoaste mecanismul molecular prin care ele transporta ionii si moleculele prin bistratul lipidic. Un ajutor substantial a venit in acest sens din partea altor metode, dezvoltate relativ recent, dintre care cea mai importanta este tehnica ADN-ului recombinant. Daca ADN-ul ce codifica proteina respectiva este clonat si secventiat, secventa de aminoacizi a proteinei poate fi dedusa si numarul de -helixuri transmembranare poate fi estimat prin analize adecvate (testul de hidropatie). Se folosesc apoi anticorpi pentru segmente specifice ale lantului polipeptidic sintetizat, ceea ce poate permite identificarea segmentelor expuse pe o parte si cealalta a membranei. Secventa de ADN ce codifica parti specifice ale proteinei poate fi modificata printr-o mutageneza pe situs specific si mARN-ul mutant corespunzator poate fi injectat in celule animale din cultura sau in ovocite de Xenopus, unde acesta va sintetiza o proteina mutanta, a carei functie de transport poate fi usor studiata. Astfel se pot identifica segmentele de proteina si secventa lor de aminoacizi importante din punct de vedere functional. Studii de acest gen au relevat ca transportul membranar este mediat de un numar surprinzator de mic de familiide proteine, a caror membri au stucturi inrudite, mecanisme de actiune, probabil,

7 asemanatoare si o origine evolutiva comuna. O familie contine insa un numar foarte mare de proteine diferite si chiar pentru un membru specific al familiei exista deseori multe variante, numite isoforme. Superfamilia transportorilor ABC ATPazele implicate in rezistenta la medicamente si fibroza cistica Denumirea de superfamilie a transportorilor ABC provine de la faptul ca fiecare membru contine aceeasi caseta pentru legarea ATP (fig. 4). S-au descris peste 50 de asemenea transportori, fiecare fiind specific pentru un substrat sau o clasa de substraturi. Varietatea de substante transportata de aceasta superfamilie este foarte larga, incluzind acizi aminati, zaharuri, ioni anorganici, polizaharide, peptide si chiar proteine. Desi majoritatea membrilor familiei au fost descoperiti la procariote, un numar tot mai mare continua sa fie descoperit in celule eucariote. Primii membri ai familiei identificati in celulele eucariote au fost descoperiti datorita capacitatii lor de a transporta substantele hidrofobe in afara celulei. Unul dintre acestia este asa zisa MDR-multidrug resistance protein, a carei superexpresie in celulele canceroase face ca acestea sa fie rezistente simultan la o varietate de citotoxice de formule diferite, larg utilizate in chemoterapia cancerului. Tratarea cu oricare din aceste substante rezulta in selectia celulelor cu o superexpresie a proteinei transportoare MDR; transportorii pompeaza substantele citotoxice spre exteriorul celulei, reducind astfel citotoxicitatea lor si conferind celulei rezistenta pentru o mare varietate de agenti terapeutici. Un fenomen similar, la fel de sinistru, are loc in Plasmodium falciparum, care produce malaria. Peste 200 de milioane de oameni sunt infectati cu acest parazit care ramine cauza majora a mortalitatii umane, omorind peste un milion de oameni pe an. Controlul malariei este ingreunat de dezvoltarea rezistentei la cloroquina substanta ce combate malaria; s-a demonstrat ca P. Falciparum rezistente la cloriquina contin gene amplificate pentru un transportor ABC ce transporta cloroquina in afara celulei. La vertebrate, majoritatea celulelor contine in membrana reticolului endoplasmic (ER) un transportor ABC ce transporta activ dinspre citosol spre ER peptidele provenite din degradarea proteinelor. Acesta reprezinta primul pas in importanta cale de supraveghere a celulelor de catre sistemul imun. Fragmentele de proteina transportate care au intrat in ER, sunt aduse apoi la suprafata celulei, unde sunt inspectate de limfocitele citotoxice T care ucid celula daca proteinele se dovedesc straine (cum sunt, de pilda, acelea provenite dintr-un virus intrat in celula). Un alt membru al familiei ABC a fost descoperit pe parcursul studierii cunoscutei boli genetice fibroza cistica. Aceasta boala este cauzata de o mutatie in gena ce codifica un transportor ABC care functioneaza drept canal de Cl- in membrana plasmatica a celulelor epiteliale. Acest canal este neobisnuit, in sensul ca necesita si hidroliza ATP si fosforilarea dependenta de AMP- ciclic pentru a se deschide. Intrucit s-a observat ca proteina MDR poate functiona si drept canal de Cl- si ca proteina trnsportoare, apare clar ca unii transportori ABC pot functiona si pe post de transportori si de canale ionice. Nu se stie inca cum pot functiona in aceste doua moduri diferite, transportind prin membrana o asemenea varietate de molecule. Tabelul 1 prezinta citeva din familiile structural inrudite din superfamilia ABC.

Ionoforii Ionoforii sunt molecule mici hidrofobice care se dizolva in bistratul lipidic si cresc permeabilitatea acestuia pentru ioni anorganici specifici. Majoritatea ionoforilor sunt sintetizati de microorganisme si sunt presupusi a fi arme biologice impotriva competitorilor sau a predatorilor (distrugandu-le gradientii ionici transmembranari). Ionoforii sunt larg folositi in biologia experimentala pentru a creste permeabilitatea ionica a membranei. Se cunosc doua clase de ionofori-purtatori mobili de ioni si formatori de canal

8 (Fig.11). Ambele tipuri realizeaza mascarea sarcinii ionului transportat astfel incit acesta sa poata penetra prin miezul hidrofob al membranei. Intrucit ionoforii nu sunt cuplati la surse de energie, ei permit o miscare neta a ionilor numai de-alungul gradientului electrochimic. Exemple de ionofori purtatori mobili de ioni: 1/Valinomicina - transporta K+, preluindu-l de o parte a membranei si eliberindu-l pe partea cealalta 2/Ionoforul A23187 - transporta ioni divalenti ca Mg2+ si Ca2+. In mod normal transporta un ion divalent intr-o directie la schimb cu doi H+ in directie opusa. Daca o celula se expune ionoforului A23187, Ca2+ din mediul extracelular intra in citosol conform gradientului sau electrochimic. De aceea , acest ionofor este larg utilizat in biologia celulara pentru a mima procese de semnalizare celulara mediate de Ca2+. Exemplu de ionofor formator de canal: Gramicidina A. Gramicidina A ese canalul ionic cel mai simplu si cel mai bine caracterizat. Contine 15 aminoacizi asezati intr-un peptid liniar, toti avind lanturi laterale hidrofobice. Se presupune ca doua molecule de gramicidina se asociaza , formind un canal transmembranar ce traverseaza bistratul, permitind, in mod selectiv, ionilor monovalenti sa se scurga de-alungul gradientului lor electrochimic (Fig.12). Dimerii de gramicidina sunt instabili, formindu-se si disociindu-se continuu, astfel ca timpul mediu de existenta al unui canal deschis este de cca 1 secunda. In conditiile unui gradient electrochimic mare, gramicidina A transporta 20 000 de cationi per canal deschis in fiecare milisecunda, ceea ce este de 1000 de ori mai mult decit poate transporta un singur transportor mobil in acelasi timp. Gramicidina este produsa de anumite bacterii, probabil pentru a ucide alte microorganisme prin anularea gradientilor lor trasmembranari de K+, Na+ si H+ care sunt esentiali pentru supravietuirea acestora si a fost de aceea folosita ca antibiotic.

Canalele ionice Proteinele canal formeaza pori hidrofilici prin membrana. Aceste proteine permit in special transportul ionilor anorganici si de aceea se numesc canale ionice. Din punct de vedere al eficientei transportului, au un avantaj asupra proteinelor transportoare, putind transporta peste 1000 000 de ioni pe secunda ceea ce depaseste de 1000 de ori viteza de transport a tuturor proteinelor transportoare cunoscute. Canalele nu sunt cuplate la surse de energie, mediind un transport pasiv. Functia canalelor ionice consta, deci, in a permite unor ioni anorganici specifici, respectiv Na+, K+, Ca2+ si Cl- sa difuzeze rapid conform gradientului lor electrochimic.

Proprietatile canalelor ionice Doua proprietati importante deosebesc canalele ionice de niste simpli pori aposi. Prima este selectivitatea ionica, adica faptul ca unii ioni pot trece iar altii nu. Aceasta sugereaza ca unele portiuni ale canalului sunt suficient de inguste ca trecerea ionului sa depinda de dimensiunea sa. Se presupune ca majoritatea ionilor se dezbraca de invelisul de molecule de apa pentru a trece, unul cite unul, prin portiunile cele mai inguste ale canalului si aceasta limiteaza viteza lor de trecere. Astfel, pe masura ce concentratia ionilor creste, fluxul ionilor prin canal creste in mod proportional dar se satureaza apoi, atingind o viteza maxima. Portiunea din por ce se ingusteaza pina la dimensiuni atomice constituie filtrul de selectivitate ionica ce detemina , in esenta, selectivitate canalului. O a doua proprietate importanta ce distinge canalele ionice de porii aposi este aceea ca primele nu sunt deschise tot timpul. Canalele prezinta porti care se deschid pentru scurt timp si se inchid din nou. De cele mai multe ori, portile se deschid ca raspuns la stimuli specifici. Cele mai cunoscute tipuri de stimuli ce determina deschiderea canalelor ionice sunt modificari ale potentialului de

9 membrana (voltage-gated channels), stresul mecanic (mechanically gated channels) sau legarea de o molecula (ligand-gated channels). Ligandul poate fi un mediator extracelular, respectiv un neurotransmitator (transmitter-gated channels), un mediator intracelular, de exemplu un ion (ion-gated channels) sau un nucleotid (nucleotide-gated channels). In plus, activitatea multor canale este reglata si de fosforilarea si defosforilarea proteinei canal. Pina in prezent au fost descrise peste 100 de tipuri de canale ionice si altele urmeaza procesul de descoperire si descriere. Canalele raspund de excitabilitatea celulelor musculare si mediaza majoritatea formelor de semnalizare in sistemul nervos. O celula nervoasa contine de regula 10 sau mai multe tipuri de canale ionice, localizate in diferite zone ale membranei plasmatice. Le gasim nu numai in celulele excitabile. Canalele ionice sunt prezente in toate celulele animale, in celulele vegetale si la microorganisme; ele propaga, de exemplu, raspunsul de infasurare a frunzei in mimoza pudica si permit parameciului sa-si schimbe directia de navigare dupa impactul cu un obstacol. Cele mai raspindite canale ionice sunt, probabil, cele selectiv permeabile pentru K+. Aceste canale sunt prezente in membrana plasmatica a majoritatii celulelor animale. O subclasa importanta a acestora este descrisa ca fiind activa chiar in celula nestimulata, in stare de repaos , numindu-se de aceea canale de scurgere a K+ (K+ leak channels). Facind ca membrana plasmatica sa fie mult mai permeabila pentru acest ion decit pentru altii, aceste canale joaca un rol esential in mentinerea potentialului de membrana, respectiv a diferentei de potential dintre cele doua fete ale membranei plasmatice. Potentialul de membrana Potentialul de membrana apare datorita unei diferente de sarcina electrica pe cele doua fete ale membranei, respectiv atunci cind avem un exces de sarcini pozitive fata de cele negative pe o parte a membranei si o lipsa pe partea cealalta. In celulele animale, potentialul electric prin membrana este determinat, in principal, de miscarea pasiva a ionilor. Am vazut anterior ca pompa Na+ -K+ ajuta la mentinerea echilibrului osmotic al celulei animale prin excluderea continua a Na+ din celula. In lipsa Na+, alti ioni pozitivi trebuie sa existe din belsug in celula pentru a compensa sarcina negativa a anionilor fixati in celula (molecule organice incarcate negativ ce nu o pot parasi). Acesti ioni sunt cei de K+, ce sunt pompati activ in celula de ATPaza Na+-K+ si pot, deasemenea, sa curga liber din celula prin canalele de scurgere a K+ din membrana plasmatica. Din cauza prezentei acestor canale ionice, K+ ajunge aproape la echilibru, adica forta electrica exercitata de ionii negativi fixati in celula este echilibrata de tendinta K+ de a iesi din celula conform gradientului sau de concentratie. Potentialul de membrana este determinat de aceasta forta electrica si valoarea sa de echilibru se poate calcula din marimea gradientului de concentratie. Fluxul oricarui ion prin proteina membranara canal este determinat de gradientul electrochimic al acelui ion. Acest gradient reprezinta combinatia a doua influiente: gradientul de potential si gradientul de concentratie prin membrana. Cind cele doua influiente sunt egale, gradientul electrochimic al acelui ion ese zero si nu avem un flux net al acelui ion prin canal. Gradientul de potential (potentialul de membrana) la care se atinge acest echilibru se numeste potential de echilibru pentru acel ion. El poate fi calculat din ecuatia lui Nernst, daca se cunosc concentratiile ionului pe cele doua fete ale membranei. Potentialul de echilibru rezultant pentru totii ionii de pe fetele membranei constituie potentialul de repaos al membranei. Potentialul de membrana al unei celule animale in repaos variaza intre 20 mV si 200 mV, in functie de organism si de tipul celulei. Desi gradientul de K+ are intotdeauna o influienta majora asupra acestui potential, gradientii celorlalti ioni (si efectul de dezechilibrare produs de pompe), au de asemenea, un efect semnificativ: cu cit este membrana mai permeabila pentru un anumit ion, cu atit potentialul de membrana este determinat mai mult de valoarea de echilibru

10 pentru acel ion. In consecinta, orice modificare a permeabilitatii ionice a membranei atrage dupa sine modificarea potentialului de membrana. Acesta este principiul de baza care leaga excitabilitatea electrica a celulelor de activitatea canalelor ionice. Intrucit celulele nervoase sunt specializate in excitabilitate electrica, aproape tot ce se stie despre acest subiect provine din studii pe neuroni. Canalele ionice transmitter-gated convertesc semnalele chimice in semnale electrice in cadrul sinapselor chimice Semnalele neuronale se transmit de la o celula la alta prin zone specializate de contact numite sinapse. Celulele sunt izolate electric una de alta, celula presinaptica fiind separata de cea postsinaprica printrun spatiu sinaptic ingust. O modificare in potentialul electric al celulei presinaptice declanseaza eliberarea de catre aceasta a unor molecule mici semnalizatoare numite neurotransmitatori, ce se afla stocate in mici vezicule sinaptice atasate membranei si se elibereaza prin exocitoza. Neurotransmitatorul difuzeaza rapid prin spatiul sinaptic si provoaca o modificare electrica a celulei postsinaptice prin legarea de canalele ionice transmitter-gated. Aceste canalele ionice sunt specializate pentru conversia rapida a semnalelor chimice in semnale electrice in sinapsele chimice. Canale respective sunt concentrate in membrana plasmatica a celulei postsinaptice in zona sinapsei si se deschid tranzitoriu ca raspuns la legarea moleculelor de neurotransmitator, producind astfel o scurta modificare in permeabilitatea membranei. Spre deosebire de canelele voltage-gated responsabile pentru potentialele de actiune, canalele transmitter-gated sunt relativ insensibile la potentialul de membrana. Ele produc modificari locale de permeabilitate ce determina modificari gradate ale potentialului de membrana, in acord cu cantitatea eliberata de transmitator si timpul de persistenta al acestuia la locul eliberarii. Un potential de actiune se poate declansa in acea zona numai daca potentialul de membrana local creste suficient pentru a deschide un numar mare de canale voltage-gated prezente in membrana aceleiasi celule tinta. Canalele ionice transmitter-gated difera intre ele in unele privinte. 1/ In calitate de receptori, ele prezinta un loc de legare foarte selectiv pentru neurotransmitatorul eliberat de terminatia nervoasa presinaptica. 2/Fiind canale ionice, ele sunt inalt selective pentru tipul de ioni pe care ii lasa sa treaca prin membrana plasmatica; aceasta determina natura raspunsului postsinaptic. Neurotransmitatorii excitatori, precum acetilcolina, glutamatul si serotonina, deschid canalele ionice, determinind un influx de Na+ ce depolarizeaza membrana postsinaptica pina la un potential prag ce declanseaza potentialul de actiune. Neurotransmitatorii inhibitori, precum acidul -aminobutiric (GABA) si glicina, deschid canalele pentru Cl-, ceea ce inhiba declansarea potentialului de actiune, pastrind membrana hiperpolarizata. Concentratia ionilor de Cl- este mult mai mare in exteriorul celulei decit in interiorul ei (vezi tabelul din cursul 2). De aceea, deschiderea canalelor pentru Cl- va tinde sa hiperpolarizeze membrana, lasind sa intre ionii negativi de Cl- in celula al carei interior este deja negativ. Importanta neurotransmitatorilor inhibitori este demonstrata de efectul toxinelor care le blocheaza actiunea. De exemplu, strichnina se leaga de receptorii glicinei si, blocind actiunea glicinei, provoaca spasme musclare, convulsii si moarte. Semnalizarea chimica in sistemul nervos are loc nu numai prin canale ionice ligand-gated. In multe cazuri, moleculele semnalizatoare eliberate de terminatiile nervoase, incluzind o varietate larga de neuropeptide, se leaga indirect de receptorii ce regleaza cnalele ionice. Acestia sunt asa numitii receptori legati de proteina G si receptorii legati de enzime. Spre deosebire de semnalizarea mediata de neurotransmitaorii excitatori si inhibitori ce actioneaza prin legarea de canalele transmitter-gated, care este in general imediata, simpla si scurta, semnalizarea mediata prin atasarea liganzilor de receptorii asociati proteinei G si enzimelor este mult mai lenta, complexa si mai bogata in consecinte de lunga durata.

11

Receptorii acetilcolinei din jonctiunea neuromusculara sunt canale ionice transmitter gated Exemplul cel mai bine studiat de canal ionic transmitter gatedeste receptorul acetilcolinei din celulele muschiului scheletal. Acest canal se deschide tranzitoriu la eliberarea acetilcolinei din terminatia nervoasa in spatiul sinaptic al jonctiunii neuromusculare (sinapsa chimica specializata intre un neuron motor si o celula a muschiului scheletal). Aceasta sinapsa a fost intens cercetata, fiind usor accesibila studiului electrofiziologic, spre deosebire de majoritatea sinapselor din sistemul nervos central. Receptorul acetilcolinei ocupa un loc special in istoria canalelor ionice, fiind primul canal care a fost izolat si purificat, primul caruia i s-a determinat secventa de aminoacizi, primul care a fost reconstituit functional in bistraturi lipidice artificiale si primul pentru care s-a inregistrat semnalul electric al unui singur canal. A fost, deasemenea, primul canal a carui gena s-a clonat si s-a secventializat. Au existat cel putin doua explicatii pentru purificarea si caracterizarea rapida a acestui receptor. Una este existenta unui numar neobisnuit de mare de asemenea canale in organele electrice ale pestilor electrici (aceste organe sunt muschi specializati in eliberarea unor socuri electrice asupra pradatorilor), unde sunt accesibile izolarii si purificarii. Al doile motiv este existenta unor neurotoxine (cum ar fi bungarotoxina) in venomul unor serpi care se leaga cu mare afinitate (Ka = 109 litri/mol) si specificitate de acest receptor permitind astfel purificarea lui prin cromatografie de afinitate. bungarotoxina fluorescenta sau marcata radioactiv poate fi utilizata pentru a localiza si numara receptorii acetilcolinei. S-a stabilit in acest mod ca acestia se gasesc cu densitate mare (cca 20 000 de astfel de receptori/m2) la nivelul jonctiunii neuromusculare si aproape lipsesc din celelalte zone ale aceleiasi membrane. Receptorul de acetilcolina al muschiului scheletal se compune din 5 polipeptide transmembranare, codificate de 4 gene separate. Doua din polipeptidele pentamerului sunt identice, avind locuri de legare pentru acetilcolina. Celelalte trei polipeptide au o structura diferita de primele doua. Cind doua molecule de Ac se leaga de complexul pentameric, ele induc o modificare conformationala care deschide canalul. Acesta ramine deschis cca 1 msec si apoi se inchide; ca si canalele voltage-gated de Na+, forma deschisa a canalului de Ac are o viata scurta si trece repede in forma inchisa, de energie libera mai joasa (fig.8, 11 ). Urmeaza desprinderea Ac de receptor hidrolizarea ei de catre o enzima specifica (acetilcolinesteraza) localizata in jonctiunea neuromusculara (fig.10). Eliberat de neurotransmitator, receptorul acetilcolinei revine la forma initiala de repaos. Forma generala a receptorului Ac si aranjamentul probabil al subunitatilor sale au fost determinate prin combinarea datelor de microscopie elecronica si difractie de raze X la unghiuri mici pe receptori cristalizati. S-a dedus astfel ca cele 5 subunitati sunt aranjate sub forma unui inel ce formeaza un canal apos transmembranar (fig.12). Acesta consta dintr-un por ingust prin bistratul lipidic si doua intrari largi dinspre cele doua fete ale membranei. Aglomerari de resturi de aminoacizi incarcate negativ , aflate la fiecare capat al porului, permit excluderea ionilor negativi si incurajeaza trecerea oricarui ion pozitiv cu diametrul mai mic de 0.65 nm. Traficul obisnuit consta in transportul voltage-gated al ionilor de Na+ si K+ insotiti de putin Ca2+. Observam deci, ca spre deosebire de canalele cationice voltage-gated, in cazul de fata avem o selectivitate cationica scazuta si contributia relativa a diferitilor cationi la curentul prin canal depinde in principal de concentratiile lor, respectiv de gradientii lor electrochimici. Cind celula musculara este in repaos, forta motoare pentru K+ este zero, intrucint gradientul de potential este aproape egal cu gradientul de concentratie al K+ prin membrana. In cazul Na+, in schimb, gradientii de potential si de concentratie actioneaza in aceeasi directie , atragindu-l spre interiorul celulei. Acelasi lucru este valabil pentru Ca2+ dar concentratia extracelulara a acestuia este mult mai scazuta decit a Na+, astfel ca acesta contribuie foarte putin la curentul spre interior. In

12 consecinta, deschiderea canalelor receptoare pentru Ac duce la un amplu influx net de Na+ (cu o viteza de virf de cca 30 000 de ioni per canal in fiecare secunda). Acest influx depolarizeaza membrana, semnalizind muschiului sa se contracte.

Canalele ionice cu poarta de potential (voltage-gated) Membrana plasmatica a tuturor celulelor excitabile (celule neuronale si musculare, celule endocrine si ovocite) contine canale ionice cu poarta de potential, responsabile pentru generarea potentialelor de actiune. Potentialul de actiune ese declansat de depolarizarea membranei plasmatice, adica de o modificare a potentialului de membrana spre o valoare mai putin negativa. In nervi si celulele musculare, un stimul ce determina o depolarizare suficienta a membranei plasmatice, provoaca o deschidere prompta voltage gated a canalelor de Na+, permitind unei canititi mici de Na+ sa intre de-alungul gradientului sau electrochimic. Influxul de sarcini pozitive depolarizeaza si mai mult membrana, determinind deschiderea a noi canale de Na+ prin care intra si mai mult Na+ ce depolarizeaza si mai mult membrana. Acest proces ce se autoamplifica, face ca intr-o fractiune de secunda, potentialul de membrana sa sara de la valoarea sa de repaos de 70 mV la aproximativ +50 mV, ceea ce reprezinta aproape potentialul de echilibru electrochimic al Na+, astfel ca forta motoare pentru ionii de Na+ devine practic zero si celula ar trebui sa se stabileasca la o noua stare de repaos, in care canalele de Na+ sunt deschise. Acest spasm electric este evitat intrucit canalele de Na+ au un mecanism automat de inactivare, ce determina inchiderea rapida a canalelor chiar daca membrana mai este depolarizata. Canalele ramin in aceasta stare inactivata, incapabile sa se deschida, timp de citeva milisecunde dupa ce potentialul de membrana a revenit la valoarea sa negativa initiala. Depolarizarea locala in cadrul potentialului de actiune se propaga la zonele vecine, care parcurg acelasi ciclu. Mecanismul electrochimic al potentialului de actiune a fost pentru prima data stabilit printr-o serie de experimente faimoase, efectuate in anii 1950 pe axonii giganti de squid, in care se putea patrunde cu microelectrozi de sticla; ele au condus la cunoscutul model ce descrie generarea si propagarea potentialului de actiune (modelul Hodgkin si Huxley). Metoda patch-clamp Atit membrana celulei nervoase cit si cea a celulei muschiului scheletal contin multe mii de canale de Na+ voltage gated iar curentul care trece prin membrana este suma curentilor ce trec prin aceste canale. Acest curent rezultant poate fi masurat cu un electrod intracelular. Se poate insa masura si curentul ce trece prin canale individuale. Tehnica inregistrarilor patch-clamp a revolutionat studiul canalelor ionice permitind studiul transportului printr-o singura proteina canal dintr-un petec de membrana ce acopera gura unei micropipete (fig.11-25). Cu ajutorul acestei tehnici simple dar eficiente s-au studiat proprietatile detaliate ale canalelor ionice in diferite tipuri de celule, stabilindu-se ca si celule neexcitabile au in membrana lor plasmatica o intreaga varietate de canale voltage-gated. Inregistrarile patch clamp au stabilit caracterul tot-sau-nimic al deschiderii canalelor de Na+; momentele deschiderii sunt intimplatoare, dar odata deschis, canalul are intotdeauna aceeasi conductanta ce permite trecerea a peste 8000 de ioni pe milisecunda. Astfel curentul rezultant ce traverseaza membrana intregii celule reflecta numarul total de canale din membrana deschise la un moment dat si nu gradul de deschidere al unui anumit canal.

13 Fenomenul de voltage gating poate fi explicat pe baza unor principii fizice simple. Interiorul celulei neuronale sau musculare in repaos este la un potential cu 50-100 mV mai negativ decit mediul extern. Aparent mica, aceasta diferenta de potential este aplicata pe o membrana avind grosimea de 5 nm, asfel ca gradientul de potential rezultant este de 100 000 V/cm. Proteinele membranare sunt supuse astfel unui cimp electric foarte puternic. Proteinele prezinta un numar de sarcini la suprafata precum si legaturi chimice polarizate intre diferiti atomi; prin urmare cimpul electric exercita forte asupra structurii moleculare. Canalele voltage-gated adopta o serie de conformatii alternative a caror stabilitate depinde de intensitatea cimpului aplicat. Salturile de la o conformatie la alta pot fi detrminate de un impuls suficient venit din partea miscarii termice a mediului ambiant al canalului. Modificarea potentialului de membrana altereaza deci stabilitatea relativa a starilor inchis, deschis si inactiv ale canalului. Cind membrana este in repaos (polarizata), conformatia inchis a canalului are cea mai scazuta energie libera si este, ca atare, cea mai stabila; cind membrana este depolarizata, energia conformatiei deschis este mai scazuta si astfel exista o probabilitate mare de deschidere a canalului. Dar energia libera a starii inactivat este si mai scazuta, si astfel dupa un timp variabil intimplator petrecut in starea deschisa, canalul se inactiveaza. Astfel conformatia deschis corespunde unei stari metastabile care exista doar tranzitoriu. Canalele voltage-gated sunt inrudite evolutiv si structural Canalul de Na+ nu este singurul canal cu poarta de potential ce poate genera un potential de actiune; potentialele de actiune din unii muschi, ovocite si celule endocrine, de exemplu, depind mai degraba de canale de Ca2+ decit de cele de Na+. Mai mult chiar, s-a stabilit existenta unor canale voltage gatedde Na+, K+ si Ca2+ cu o functie necunoscuta in celule ce nu sunt in mod normal electric active. Tehnica ADN recombinant a permis insa stabilirea faptului ca secventa de aminoacizi a tuturor canalelor voltage gatedde Na+, K+ si Ca2+ cunoscute este foarte asemanatoare, sugerind ca toate apartin aceleiasi mari superfamilii de proteine inrudite evolutiv si structural. Cel mai bine studiat ca relatie structura-functie este canalul de K+. Acesta consta din 4 subunitati , a caror secventa de aminoacizi sugereaza ca fiecare subunitate consta din 6 -helixuri ce traverseaza membrana. Nici unul din acestea nu captuseste insa porul, ci un alt segment de 20 de aminoacizi, orgnizati in foi antiparalele traverseaza membrana captusind porul. Capatul NH2 terminal al aminoacidului din pozitia 19 al proteinei este implicat in inactivarea rapida a canalului. Daca aceasta regiune este alterata, cinetica canalului se modifica iar daca aceasta zona este indepartata, inactivarea nu mai are loc. Mai mult, inactivarea se reface daca fata citosolica a membranei se expune unei mici peptide sintetice corespunzatoare amino-terminalului indepartat. Aceste detalii asupra relatiei structurafunctie s-au stabilit prin studii minutioase pe proteine canal mutante, sintetizate prin tehnica ADN recombinant. Aceeasi tehnica a permis identificarea unuia din -helixuri ce traverseaza membrana, (ce se reproduce cu fidelitate in toate canalele cu poarta de potential cunoscute) ca fiind sensorul de potential al acestor canale; daca oricare din resturile incarcate electric ale aminoacizilor din aceasta spirala se modifica, raspunsul canalului la schimbarile de potential ale membranei nu mai are loc.