Laborator Microbiologie Generala - 2011-2012

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE GENERALA
L.1. Reguli de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie; Microscopul. Utilizarea microscopului L.2. Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin colorare simpla L.3. Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin colorare difereniala L.4. Studiul microbiologic al drojdiilor (Saccharomyces, Pichia, Torulopsis) L.5. Studiul microbiologic al drojdiilor (Candida, Rhodotorula, Kloeckera) L.6. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Mucor, Rhizopus) L.7. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus glaucus, Penicillium expansum) L.8. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Botrytis, Geotrichum, Alternaria, Fusarium, Cladosporium) L.9. Tehnici de izolare a culturilor pure L.10. Tehnici indirecte (culturale) de evaluare a numrului de microorganisme - Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense L.11. Metoda direct de numrare a bacteriilor n preparate fixate i colorate - Metoda Breed L.12. Metode directe de numrare - Numrarea cu citometre de mediu asupra dezvoltrii L.13. Influena factorilor microorganismelor
Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor
REGULI DE PROTECIE A MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

ntr-un laborator de microbiologie trebuie respectate anumite reguli de ordine interioar, dup cum urmeaz: Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator; Intrarea n laborator i participarea la lucrrile practice se va face numai dup audierea i nsuirea regulilor de protecie a muncii (dovedit prin semntur pe un proces verbal); Intrarea n laboratorul de microbiologie necesit purtarea obligatorie a echipamentului de protecie (halat cu mneci lungi, mnui sterile, etc.). Se recomand ca echipamentul de protecie s fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior; Nu se mnnc i nu se fumeaz n laborator. Manipulrile trebuiesc efectuate cu multa atenie, chiar dac nu se lucreaz cu microorganisme patogene. Culturile, preparatele microscopice umede, toate materialele care conin sau s-au aflat n contact cu microorganisme vii trebuie mnuite cu grija. n laboratorul de microbiologie, poate exista i pericolul generat de utilizarea tensiunii nalte, a radiaiilor ultraviolete i a altor radiaii. Radiaiile ultraviolete (=250-270 nm) sunt folosite pentru sterilizarea aerului i suprafeelor de lucru. iradierea se face timp de 15 min - 2 ore, n funcie de dimensiunea ncperii i gradul presupus de contaminare a aerului. n timpul funcionarii lmpii, nu este permis accesul personalului n ncpere dect cu ochelari de protecie i pentru scurta durata, deoarece razele ultraviolete ataca retina, iar in doze mari pot produce arsuri ale epidermei; Rnile i zgrieturile de pe mini trebuie s fie complet protejate de pansamente rezistente la apa i de mnui chirurgicale; S se evite pe ct posibil atingerea prului, innd cent ca nivelul de contaminare a acestuia este de aproximativ 1 milion/cm2. Persoanele cu pr lung este necesar s-l strng, pentru a evita accidentele, innd seama ca de obicei se lucreaz n. apropierea becului de gaz;
1
Cnd o cultura este pipetat din greeala pe bancul de lucru sau pe podea, nu va grbii s tergei locul respectiv, ci aplicai peste suspensia respectiva o soluie dezinfectanta, ateptai aproximativ 20 minute i abia apoi curai;
Laborator Microbiologie general|
Evacuarea rapid a coninutului pipetelor poate produce aerosoli. Aerosolii pot fi generai i la mnuirea firului sau ansei, i la ndeprtarea dopului de vata sau de cauciuc din eprubetele cu culturi i la deurubarea capacelor sticlelor cu culturi. n general, n munca din laboratorul de microbiologie se prefera micrile lente, negrbite; Utilizarea firului sau ansei necesit bune deprinderi la mnuirea acestora, pentru a se evita contaminarea aerului i a zonei de lucru. Firul i ansa trebuie s fie sterilizate nainte i dup utilizare, prin flambare la rou, n flacra unui bec Bunsen pe toata lungimea firului metalic. mprtierea materialului aderent se evita prin introducerea firului metalic n flacra, n mod gradat; Eprubetele cu culturi vor fi inute ntotdeauna n stativele pentru eprubete. Nu lsai niciodat eprubete sau pipete utilizate pe bancul de lucru. Placa Petri n care se numra microorganismele nu va fi privit ca fiind lipsita de risc, chiar dac inocularea ei s-a fcut dintr-un aliment bun pentru consum; Dopul de vat de la captul pipetei se afl acolo pentru a preveni contaminarea lichidului care trebuie pipetat i pentru a preveni infectarea utilizatorului. Pipetele folosite nu se vor lsa nici o data pe bancul de lucru. Ele se vor introduce ntr-un recipient coninnd soluie dezinfectant (bicromat de potasiu 5%). Lamele i lamelele se vor aeza dup utilizare n vase coninnd soluii dezinfectante, dup ce n prealabil lamelele au fost separate de lame cu ajutorul unei pensete; S se eticheteze corect culturile nainte de depozitarea lor la termostate sau n alte zone; Dup terminarea lucrului se va cura zona de lucru. Aceasta se va terge cu o soluie dezinfectanta (cloramina 6.5-3%, formol sau fenol 3-5%, HgCI2 0.1%). Minile se igienizeaz prin introducerea lor ntr-o substan antiseptic pentru cteva minute, apoi se spal cu ap cald si spun.
MICROSCOPUL. UTILIZAREA MICROSCOPULUI

Microscopul este instrumentul cel mai utilizat i cel mai important n laboratorul de microbiologie. Cu ajutorul microscopului optic se realizeaz studiul morfologic al microorganismelor (bacterii, drojdii i mucegaiuri) i numrarea direct a acestora. Studiul virusurilor i a ultrastructurilor celulare necesita utilizarea microscopului electronic.
Reguli de utilizare a microscopului ntotdeauna microscopul se transport cu dou mini, o mn se aeaz la baza, iar cu cealalt se prinde coloana sau stlpul microscopului; Se aeaz cu atenie microscopul pe masa de lucru. n cazul unei micri violente sau dup un oc acesta se poate deregla; Nu se nclin niciodat microscopul, chiar dac exist aceast posibilitate. Cnd se utilizeaz obiectivul de imersie, prin inclinare, uleiul de cedru se rspndete pe msua microscopului; Pentru curare, ntotdeauna se folosete hrtie special pentru curarea lentilelor. Dac rezultatele nu sunt corespunztoare prin utilizarea hrtiei, se poate folosi o cantitate mic de benzen. Nu se va utiliza alcoolul sau alt produs care-poate determina desprinderea lentilelor; S se observe permanent diferenele dintre obiectivele folosite pentru studiul preparatelor microscopice umede i obiectivele de imersie (pentru studiul preparatelor microscopice colorate). Obiectivul de imersie este fragil, el trebuie utilizat cu foarte mult atenie; De fiecare data cnd se utilizeaz microscopul este necesar s se curee toate lentilele: ale obiectivului, ocularului i condensatorului; Se aeaz ntotdeauna n centrul optic al microscopului obiectivul cel mai mic i se coboar tubul ct este posibil; Se acoper microscopul dup utilizare cu un sistem de protecie;
1
Nu se vor ntreprinde niciodat reparaii. Acest lucru se realizeaz de ctre echipele specializate.
Elementele microscopului Microscopul se compune dintr-un stativ portant, un sistem optic, o msu port-obiect i un sistem de iluminare. Sistemul optic i msua sunt mobile.
1 Oculare 2 Dispozitiv port-obiective 3 Obiective 4 Clema pentru fixarea preparatului 5 Msu urub macrometric pentru prinderea 6 imaginii
urub pentru deplasarea pe axa y urub micrometric pentru clarificarea 8 imaginii 9 urub pentru deplasarea pe axa x 10 Buton de pornire oprire 11 urub de ajustare a luminozitii 7 12 Lampa
Ocularele Curent se utilizeaz oculare care au puterea de mrire de x8, x10, x12. Obiectivele Dispozitivul port-obiectiv permite selecionarea obiectivului dorit prin simpla rotaie. Obiectivele utilizate n microbiologie sunt n general obiective acromatice i dac este posibil plan-acromatice. Gama obiectivelor necesare au puterea de mrire de x10, x20, x40, iar obiectivele de imersie au puterea de mrire de x90, x100. Msua port-obiect Msua port-obiect reprezint un suport pentru lam. Deplasarea pe cele doua axe orizontale perpendiculare se realizeaz cu ajutorul unui urub situat lateral. Sistemul de iluminare Se compune dintr-o sursa de lumina i un condensator. Condensatoarele curente sunt dotate cu o diafragma. Sistemul de iluminare este independent sau ncorporat n microscop. Sistemul de deplasare a obiectivelor Se realizeaz cu un urub pentru micrile rapide i un alt urub pentru reglare micrometric. Distanta frontal, adic distanta ntre preparat i obiectiv, depinde de puterea de mrire a obiectivului. Puterea de mrire Puterea de rezoluie este capacitatea de separare a doua obiecte foarte apropiate. Puterea de mrire variaz de la 100-1200 corespunztor sistemului oculare obiectiv utilizat. Se calculeaz prin produsul dintre puterea de mrire a ocularului i a obiectivului.
Utilizarea microscopului Curarea cu ajutorul unei hrtii speciale a elementelor optice ale microscopului; Reglarea luminozitii; Fixarea preparatului pe msu cu ajutorul unei cleme. Partea preparatului care intereseaz se aeaz n centrul port-obiectului;
3
Obiectivul este selecionat: iniial se fixeaz obiectivul cu puterea de mrire cea mai mic (x10) pentru prinderea imaginii; Se coboar obiectivul la o distan de 0.5-1 cm de preparat cu ajutorul urubului
macrometric; Pentru studiu se schimba obiectivul cu un altul cu putere de mrire superioar prin rotirea dispozitivului port obiective; Dup obinerea imaginii, se realizeaz clarificarea acesteia cu ajutorul urubului micrometric; n cazul utilizrii obiectivului de imersie, se depune o pictur de ulei de imersie n zona care intereseaz i se imerseaz obiectivul n aceasta zon; Dup utilizare, obiectivele de imersie trebuie sa fie curate cu benzen; Lamele examinate vor fi imediat ndeprtate pentru a se evita contaminarea.
Cauzele care duc la obinerea unor imagini necorespunztoare sunt: Executarea unor preparate necorespunztoare; Preparate care nu sunt centrate corespunztor; Elemente optice murdare; Obiective i oculare dereglate; Luminozitate reglat necorespunztor.
STUDIUL BACTERIILOR
Definiie Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar. Rspndire n sol - concentraia de celule poate ajunge la valori de 107-109/g att n straturile superficiale (bacterii aerobe), ct i n straturile de profunzime (bacterii anaerobe). din sol, bacteriile s-au adaptat s triasc n ape, unde concentraia de celule poate fi ntre 10/cm3 n apa de izvor, pn la valori de 1012/cm3, de exemplu, n ape fecalo-menajere. existena n aer a bacteriilor este temporar i prin intermediul curenilor de aer sunt rspndite la distane foarte mari. Din aer, sunt antrenate din nou n sol prin intermediul precipitaiilor atmosferice. fac parte din microbiota naturala a plantelor i animalelor Rol rol important n natur: n transformarea compuilor macromoleculari n compui simpli, prin mineralizarea materiei organice nevii, contribuind astfel la realizarea natural a circuitului unor elemente de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor, fier .a. n industria alimentar - culturi starter al proceselor fermentative bacteriile lactice sunt folosite la fabricarea produselor lactate, a brnzeturilor, n industria panificaiei, la conservarea legumelor, mslinelor, furajelor verzi etc. bacteriile propionice sunt utilizate la fabricarea brnzeturilor tip schwaitzer bacteriile acetice la fermentaia alcoolului etilic obinerea industrial a oetului. n biotehnologie se pot obine: enzime, proteine, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, solveni (aceton, alcool izopropilic, alcool butilic); hormoni insulina produs de un mutant de Escherichia coli; ngrminte biologice Azotobacter; insecticide biologice Bacillus thuringiensis; antibiotice Streptomyces sp. vitamine de ex. vitamina B12 Propionibacterium shermani
1
Aspecte negative: n industria alimentar bacterii ageni de alterare a produselor alimentare (acrirea berii, vinului, putrefacia crnii .a.);
bacterii patogene ingerare alimente contaminate toxiinfecii alimentare; bacterii patogene pot s paraziteze organismele vii dnd mbolnviri grave (tuberculoza, febra tifoid, dizenteria, sifilis, bruceloza, antrax, .a.), bacterioze la plante. Caractere morfologice Bacteriile prezint forme celulare foarte diversificate, dintre care forme de baz, monocelulare, precum i forme derivate ale acestora ce rezult n urma asocierii celulelor rezultate prin reproducere. Dintre formele de baz fac parte urmtoarele (Anexa 2): - forma sferic coccus sfera este perfect (micrococi), ovalar (enterococi), lanceolat (pneumococi) i reniform (gonococi); - forma bacilar cilindric drepte cu capete rotunjite (g. Enterobacter), cu capete retezate (g. Bacillus), fusiforme, mciucate (g. Corynebacterium), cu diametru variabil (g. Mycobacterium); - formele spiralate-elicoidale specifice bacteriilor patogene forma vibrio forma spirillum filamente rigide cu spire largi forma spirocheta filamente flexibile cu mai multe spire; - formele filamentoase specifice bacteriilor miceliene (actinomicete, chlamydobacterii etc.). Mediul de baz pentru cultivarea bacteriilor bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar (BCA). Prin reproducere pe mediu nutritiv solidificat ia natere o colonie alctuit din biomasa de celule rezultate prin sciziune din celula unic: - colonii de tip S (smooth neted lucios) - colonii de tip R (rough rugos, aspru, zbrcit) - colonii de tip M la bacterii productoare de capsule, cu consisten gelatinoas, mucoid Coloniile de bacterii: pe medii solide culori de alb, alb-crem, galben-auriu, oranj-rou, albastru fluorescen pe medii nutritive lichide pot da tulburare i sediment bacteriile anaerobe formeaz voal caracteristic, fragil, cutat, gelatinos bacteriile aerobe. Caractere fiziologice generale bacteriile se dezvolt ntr-un domeniu larg de temperatura 10C i 90C; n raport cu oxigenul majoritatea bacteriilor sunt aerobe (ex. bacterii acetice), care cresc n semiaerobioz (ex. bacterii lactice), dar un grup restrns de bacterii sunt adaptate s creasc n strict anaerobioz (ex. genul Clostridium). pH=1-11 optim la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacie.
Facultatea a tiina i Ing gineria Alimen ntelor
STUDIU S L BACT TERIILOR R PRIN COLOR RARE SIM MPL

Prepara atele micros scopice sunt de dou tipuri: A. B. Preparate e umede pentru stu udiul drojdii ilor si a mu ucegaiurilor r; Frotiuri (p preparate-u uscate) pe entru studiu ul bacteriilo or.
Coloranii utilizai n studiul bacteriilor b au a ca scop accentuare ea contrast tul prepara atelor (colorar re simpl) sau n sco opul identificrii (color rrile difer reniale). Colorare ea simpl prezint p do ou etape: 1. Ob O inerea fr rotiurilor; 2. Colorarea C simpl prop priu-zis.
Etapele prelevrii probelor pe entru realiz zarea frotiu urilor sunt p prezentate n figura 1.
Figu ura 1. Etapele prelev rii probelo or

La aborator Micro obiologie gen neral|
Obinere ea frotiurilo or presupu une etalare ea celulelo r de studia at, urmat de uscare e, de fixare i de colorar re (Fig. 2)
F R O T I U
1. Sterilizare lam m 2. Ad A ugare ap diistilat 3. Sterilizare ansa 4. Prelevare pro ob 5. Plasare P prob pe e lam 6. Etalare prob b 7. Uscare 8. Fixare 9. Rcire
Figura 2. Etap pele realiz rii frotiului i Etalarea a este rea alizat porn nind de la a prelevare ea probele e, etap id dentic cu cea utilizat pentru pre eparatele um mede n sta are proasp t. Pictura a de suspe ensie se etaleaz cu ajutorul fir rului metaliic steril ast tfel nct s se obin o distribuie e foarte fin, omogen. Uscarea a se efectueaz deasupra flcrii r unui bec c de gaz pe entru a se e evita o nclzire violent. Fixarea se realizea az trecnd lama de 2-3 ori pri n flacra b becului de g gaz, dup care se realiz zeaz rcir rea. Frotiul poate p fi ana alizat n con ntinuare su ub aceasta form sau colorat.
2
Se realiz zeaz prin acoperirea a frotiurilor fixate cu c teva pict turi de colo orant timp d de 30 sec 2 min (A), du up care se e realizeaz splarea (B) i zvn ntarea prep paratelor (C C).
Examen nul microscopic se efe ectueaz cu u obiective ele de imer rsie (x90, x x100). Coloranii utilizai frecvent f sun nt: albastru u de metilen n sau fucsi ina. Etapele realizrii color c rii sim mple sunt pr rezentate n n figura 3.
C O L O R A R E S I M P L
1. Ob inere e frotiu
2. A Ad ugare colo orant (fucsin )
3. Men inere collorant 1 min.
4. Splare c colorant
5. Zvntare preparat
6. . Adugare ule ei de cedru
Figu ura. 3 Etap pele realiz rii colorrii simple

3
Bacteri iidinIA AURT
Iaurturile sunt fab bricate cu ajutorul la aptelui pas steurizat, in noculat cu u dou bac cterii termofile e: Lacto obacillus bu ulgaricus, agent a de ac cidifiere i a arom; Strep ptococcus th hermophilus s, formeaz aroma.
Exist un u sinergism m ntre cele dou bac cterii; aces stea produc c compui utili una pe entru cealalt (activitate peptidazic de ctre prima bact terie, acid f formic prod dus de cea de a doua).
1.
L Lactobacil llus bulgar ricus
Sunt bacili a alungii, G Gram poz zitivi, nesporu ulai, imo obili, homoferment tativi, termofilli (temperat tura de dez zvoltare 45 C). Fermen nteaz gluc coza, lacto oza, fructoz za i cteoda at galacto oza cu prod ducere de acid lactic.
2.
S Streptococ ccus therm mophilus
Sunt c coci, Gra am pozitiv vi, nespor rulai, imobili, grupai n n perechi i cteodat t n lanuri. Fermen nteaz lacto oza, zaharoza, glucoz za i uneori g galactoza c cu formare e de acid la actic, tempera atura maxi ma de cretere 50-52 2C.
Labo orator Microb biologie gene eral|
Bact teriidi inSM NTN N

Streptoc S occus cr remoris
Smntna S acid a este fe ermentat de d Streptoc coccus crem moris. Sunt S coci (l lanuri de coci), G+, nesporula ai, micro-aerofili, foar rte exigeni din punct de d vedere nutriional, cresc la a tempera atura de + +10C, dar nu cres sc la tempera atura de 45C. Fermenteaz F lactoza i maltoza.
Bacteri B iidinB BOR

Lactobac L cillus delb brueckii
Sunt ba acili alung gii, Gram pozitivi, ne esporulai, imobili, homofermen ntativi, term mofili (tempera atura de de ezvoltare 45 5C). Lactoba acillus delbr rueckii ferm menteaz la actoza.

orator Microb biologie gene eral| Labo
Tema: STUDIUL BACTERIILOR PRIN COLORARE SIMPL Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor i aparaturii de laborator; Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii bacteriilor
Bacterii din IAURT
Bacterii din SMNTN
Bacterii din BOR
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA Data Cadrul didactic
STU UDIUL BA ACTERIILOR PR RIN COL LORARE E DIFER RENIAL L (G GRAM)

Prepara atele micros scopice sunt de dou tipuri: A. B. Prepa arate umed de pentru u studiul dr rojdiilor si a mucegaiu urilor; Frotiu uri (prepara ate-uscate) pentru st tudiul bacte eriilor.
Coloranii utilizai n studiul bacteriilor b au a ca scop accentuare ea contrast tul prepara atelor (colorar re simpl) sau n sco opul identificrii (color rrile difer reniale). Colorare ea Gram pe ermite diviz zarea bacte eriilor n do ou grupe: GRAM PO OZITIVE (G G+) i GRAM NEGATIVE E (G-). Aceasta me etoda se bazeaz p pe diferena structur rii i compoz ziiei perete elui celular la cele do ou grupe de bacterii i. Bazele m metodei au fost stabilite de bacteriologul danez Hans Christian Gr ram, n anu ul 1884. Colorare ea GRAM prezint p do ou etape: 1. Ob O inerea fr rotiurilor; 2. Colorarea C GRAM G prop priu-zis.
Obinere ea frotiurilo or presupu une etalare ea celulelo r de studia at, urmat de uscare e, de fixare i de colorar re
Frotiul uscat u i fix xat se acop per cu cteva pictu uri de viole et de genian sau cristal violet, timp de 1 minut m (A), apoi a se cltete cu ap p (B). Se acoper a apoi prepa ratul timp de e cteva se ecunde (30 0 sec) cu solu ie Lu gol (iod n n iodura de e potasiu) care joaca ro ol de morda ant (C);
A B C Frotiul este e supus s ac iunii alcoolului etilic - 96 ( (D). Dup sp larea p preparatulu ui cu ap (E), acesta se e acoper cu al doile ea colorant t (fucsina bazic ) ca are recolore eaz celulele e bacteriilor r Gram neg gative (F).
D E F Dup sp s larea preparatulu p ui cu ap (G) se r realizeaz zvntare a (H) i apoi studiere ea acestuia a cu obiect tiv de 90x imersat n ulei de ce dru.
G H n urma a acestei metode m de colorare bacteriile b G G- vor ave ea culoarea a roz-ro ie e; iar bacteriile G+ se vor colora n violet. Prezent tarea schematic a color c rii Gr ram se reg se te n f figura 1.
1. Ob inere frotiu u
C O L O R A R E D I F E R E N I A L
2. 2 Adugare colo orant (violet de e gen ian sau cristal violet) Men in nere colorant 1 min. 3. A Adugare Lugol Me en inere 30 sec c. 4. S Splare cu alcoo ol
5. Splare cu ap
6. Ad ug gare colorant (fu ucsin ) Men in nere colorant 1 min. 7. S Splare cu ap
8. Zv vntare preparat t
9. Adu ugare ulei de cedru
Figu ura. 1 Etap pele realiz rii colorrii GRAM

ANEXA A Et tapele color c rii GRAM

Reactivi/P Prepa rat Frotiu fixat, necolorat Durat ta aplica are de Rea acii Aspec ct celule Celule f r e i dificil culoare de vizu ualizat bacteriile Att Gram pozitive ct ele Gram i ce negativ ve sunt colorat te n violet nchis. Ambele e grupe de bacteriii rmn colorat te n violet nchis. riile Gram Bacter rmn pozitiv e te n violet colorat nchis n timp ce Gram bacteriiile negativ ve devin incolor re i dificil de obs servat. Gram pozitiv ve (G+) Gram negative (G-)
Cristal viol let
1, apoi cltire e cu ap
bazici b Coloranii cu reacioneaz r grupe ncrcate gativ din pe erete neg mem mbran i citosol Iodul are efect e mor rdant i mre r te ataarea spal s Solvenii colo orantul i iodu ul din celu ule. Colora antul difu uzeaz din celula bac cteriilor Gram G poz zitive mult mai lent dec ct n cazul celor c Gra am nega ative, dato orit compo oziiei chim mice i gro osimii peretelui celular Colorantul bazic c se fixe eaz de gru upele ncrcate negativ v din de amb bele tipuri celu ule. La bacteriile Gra am pozitive sunt ns puine grupe g libe ere de cristal violet v com mparativ cu cele Gra am negative care sun nt complet liber re
Soluie Lug gol
1, apoi e cu ap cltire
Alcool etilic 96
10-15, apoi cltire e cu ap
Fucsin, colorant contrast
de
apoi 1, cltire e cu ap, zvnta are n aer cald, studiu u cu obiect tiv de 90x imersat u de n ulei cedru
Celule le Gram pozitiv e rmn colorat te n violet nchis (culoarea ntului coloran primar ) n timp ce Gram celulel e devin colorate n sau rou roz rea (culoar coloran ntului de contras st)
Bacillu ussub btilis

1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale). fo ormeaz pe e Plate Coun nt Agar, dup p 48h de c cultivare la 3 37C, coloni ii alb-crem, plate i neuniforme e.
2.
Caractere C microscop m pice bacterii cu forma f de bastona b e, G+, aerob be, mezofile e n gener ral mobile. Sunt ca aracterizai prin aptitudinea de spo orulare.
3.
Rspndire e i rol sunt foarte rspndite n n natur, n special s n so ol i pe prod dusele vege etale.
Bacteri B riidinOET
Aceto obacter a aceti
Sunt S bacili, G-, nesporulai, n ge eneral mob bili, aerobi. Sunt S ageni de fermen ntare acetic, care e este de fap pt o oxidare e incomple et a etanolului. Caracteristic C ca principa al este pro oducerea de e acid acet tic pornind de la etano ol. Prin P colorare ea Gram ele apar de culoare ro ie. Sunt S bacteri ii de contam minare a pr roduselor a alcoolizate pe care le acidific. n n industrie sunt utiliza ate pentru ob o inerea o etului.
Tema: STUDIUL MORFOLOGIC AL UNOR SPECII DE BACTERII PRIN COLORARE GRAM Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor i aparaturii de laborator; Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii bacteriilor
Bacillus subtilis
Bacterii din OET
GRUPA Data
Cadrul didactic
STUDIUL DROJDIILOR
Definiie Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i eterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot, care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori formai pe cale asexuat i sexuat.
Importan/rol produc fermentarea glucidelor simple n anaerobioz cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon fabricarea alcoolului, a vinului, berii i pinii. sunt utilizate ca surs de proteine n alimentaia uman, cu denumirea de SCP (single cell protein) sau n alimentaia animalelor. din biomasa de drojdie se obin: - extracte folosite ca aditivi alimentari; - vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol; - enzime: - fructofuranozidaza i - galactozidaza; - prin hibridizri i inginerie genetic, din mutani ai speciei Saccharomyces cerevisiae s-a obinut interferonul. Rspndire n sol, celulele de drojdie se ntlnesc n straturile superficiale pn la adncimi de aproximativ 30 cm, n concentraii de 102- 2105/g. din sol, prin aciunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele se pot afla temporar n aer i s se rspndeasc la distane mari; din sol i aer drojdiile pot ajunge n ape i unele specii pot fi ntlnite chiar la adncimi de 4000 m. in microbiota epifita a plantelor. Caractere morfologice generale Exemple de genuri cu importan in industria alimentar: forma oval (elipsoidal) g. Saccharomyces; forma sferic g. Torulopsis; forma apiculat (de lmie) g. Kloeckera; forma cilindric g. Candida; forma de sticl g. Saccharomycodes.
Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive lichide:

Fermentare anaerobaa zahrului
[1]. Tulburare mediu [2]. Producere spum [3]. Depunere sediment [4]. Limpezirea supernatantului Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu: must de mal cu agar)
nmugurire
succesiv
Coloniile de drojdii au aspect cremos lucioase sau mate alb-crem drojdii din g. Rhodotorula colonii rou-pastelat Colonia n seciune poate avea: un profil lenticular, semicircular sau triunghiular perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate Caractere fiziologice generale ale drojdiilor O proprietate important a unor drojdii cu utilizri n industria alimentar este aceea de a fermenta n condiii de anaerobioz glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon i produse secundare care dau aroma caracteristic produselor fermentate. n condiii de aerobioz, drojdiile asimileaz glucidele transformndu-le prin respiraie la CO2 i H2O, iar energia eliberat favorizeaz creterea i nmulirea celulelor. Celulele de drojdie, n funcie de condiiile de cultivare i vrst pot prezenta activitate metabolic difereniat concretizat prin trei stri n care se pot afla celulele i anume: starea de metabioz (activ), n care celulele au activitate metabolic maxim. n condiii favorabile de cultur, celulele cresc, se reproduc i acumuleaz intracelular substane de rezerv glicogen i trehaloz; starea de anabioz (latent), celulele i menin caracteristicile vitale, dar nu se pot nmuli. Aceast stare apare cnd substanele nutritive ale mediului sunt epuizate, iar celulele consum din substanele de rezerv intracelulare; starea de autoliz (moartea fiziologic). Se produce o solubilizare a compuilor intracelulari sub aciunea enzimelor proprii celulei.
2
Sacch harom mycesc cerevis siae
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale). Dup 3 zile de cultivare la a 25C, for rmeaz pe MEA (Malt Extract A Agar), co olonii de culoare alb-cr rem, conve exe, cu per rimetrul circ cular i sup prafaa lucio oas, av vnd diamet trul de 1 - 2 mm.
2.
Caractere C microscop m pice celule ele au form ma elipsoid dal, globoa as sau el lipsoidal alungit i p pot fi dis spuse singu ular, in pere echi sau lan nuri; se rep produc prin n nmugurire e, iar mugurele poate f fi alipit de c celula mam. 3. Rspndire e i rol micro oflora epifit a fructelor dulci (strug guri, mere, p pere, prune, , gutui, coac cze, ag grie); este utilizat u la: fab bricarea spir rtului; la ob o inerea drojdiei comp primate; n panificaie; la fabricarea f unor u sortime ente de bere e.
Pichia amem mbrana aefacie ens
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale).
forme eaz, pe must m de mal cu agar, colonii cu perimetrul slab lobat t sau chiar ne eregulat, cu u aspect ma at, rugos, de e culoare a alb sau alb b-cenuie. 2. Caractere C microscop m pice
prezin nt celule alungite, a cilin ndrice, cu c capetele asc cuite sau ro otunjite disp puse n lanuri u sau aso ociaii, form mnd pseu udomicelii rezultate prin nmugurire multipo olar. Poate fo orma 1- 4 ascospori. a 3. Rspndire e i rol micro oflora produs selor vegeta ale conserva ate prin mur rare; se de ezvolta pe lic chide slab alcoolice a ( 7- 9 alcool) ), producnd d oxidarea t total a alcool lului etilic; este agent de alterare a a buturilor s slab alcooliz zate (vin d de masa, b bere), pstrate e in vase cu u gol de aer. .
Torulop T psisho olmii
1.
forme eaz pe mu ust de mal cu agar, du up 3 zile d de cultivate la 25C, co olonii albe, circulate, con nvexe, aplat tizate, cu su uprafaa luc cioas. 2. Caractere C microscop m pice celule ele sunt mic ci, elipsoidale; se rep produc prin nmugurire e i apar izo olate sau as sociate; forme eaz 1-4 ascospori, a cu c form s sferic pn n la elipsoidal i p perei netezi. 3. Rspndire e i rol drojdi ia este pre ezent n saramura s n fazele in ncipiente de fermenta are a murtur rilor; a fost t izolat din buturi rcoritoare, c de e pe mslin ne verzi i fr ructe citrice.
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii drojdiilor
Saccharomyces cerevisiae
Pichia membranaefaciens
Torulopsis holmii
GRUPA Data
Cadrul didactic
Candi idava alida(C Candid damyc coderm ma)
1.
coloniile dezvolta ate pe med diu solidific cat prezint un aspect t mat, cuta at, de culoare alb-cenuie e sau uneor ri alb-crem. 2. Caractere C microscop m pice
celule ele sunt de form f elipso oidal - alung git, cilindric c, cu extre emitile rotu unjite sau slab b ascuite. pot fo orma pseu udomiceliu, deoarece prin nmug gurire multi ipolar, cel lulele rmn alipite. a 3. Rspndire e i rol face parte p din microbiota ep pifit a fructe elor i a uno or legume; n ca azuri rare, se ntlne ete n m microbiota s seminelor oleaginoas se i cerealie ere; este agent de alterare a vinurilor sllab alcoolic ce, slab su ulfitate, pro oduce defectul numit floa area vinului" "; produ uce alterri ale butur rilor rcorito oare i a p produselor conservate e prin murare.
Rh hodoto orulag glutinis s
1.
forme eaz pe MEA (Malt Extract E Aga ar), dup 3 zile de c cultivare, co olonii convexe e, cu perimetrul circula ar, cu supra afaa lucioas s sau aspe ect mucos, de culoare rou pastelat. 2. Caractere C microscop m pice
celule ele au form elipsoidal l i dimensiuni medii; ; reproduce erea are loc c prin nmugur rire pe ntrea aga suprafa a; celule e pot fi izo olate sau asociate a perechi. Unel le tulpini p pot forma c celule alungite. . 3. Rspndire e i rol este larg l rspn ndit pe sup prafaa fruct telor i legu umelor proas spt recolta ate; se ntlnete n microbiota a epifit a frunzelor i tulpinilor, a boabelo or de cereale, a mslinelo or ; poate e produce ra ar alterri ale fructelor s si legumelor r; poate e produce alterri ale e sucurilor insuficient pasteuriza ate de mere i cpuni.
Klo oecker raapic culata a
1.
forme eaz pe ME EA (Malt Ext tract Agar) d dup 3 zile de cultivare e la 25C, co olonii de culoa are alb-crem m, aproape semisferice e, cu margin ni circulare i suprafaa lucioas. 2. Caractere C microscop m pice
celule ele au fie forma fo elipso oidal, fie a apiculat, d datorit mug gurilor term minali, mono sa au bipolari, care c se gse esc singuri sau s perechi. 3. Rspndire e i rol a fost t izolat de pe cpuni; afine, struguri, must d de struguri, sucuri de c citrice i siropuri de fructe produ uce fermenta aia alcoolic c a mustulu ui de struguri; produ uce alterarea a smochinelor, tomatelo or i cireelor.
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii drojdiilor
Candida mycoderma
Rhodotorula glutinis
Kloeckera apiculata
GRUPA Data
Cadrul didactic
STUDIUL MUCEGAIURILOR
Definiie Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori formai numai pe cale asexuat sau pe cale mixt (asexuat i sexuat).
Rspndire n sol, n special n stratul superficial al solului care le asigur condiii de cretere i supravieuire. din sol, sporii de mucegai sunt antrenai pe calea aerului la distane foarte mari. n aer, mucegaiurile sub form de spori sau hife vegetative pot supravieui un timp ndelungat. n ap prezena mucegaiurilor este ocazional sporii de mucegai se ntlnesc frecvent la suprafaa plantelor, n tractul digestiv, n special la ierbivore. n microbiota plantelor, pe suprafaa fructelor i legumelor. la om i animale mucegaiurile patogene produc un numr mai redus de mbolnviri, se dezvolt pe piele, unghii, pr. Rol rol important n natur: Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurile particip la transformarea unor compui organici (celuloza, hemiceluloze, substane pectice, amidon, lipide) la compui mai simpli i sunt considerai ageni de putrezire. Mucegaiurile particip astfel la circuitul carbonului n natur i mbogesc solul n substane cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganisme sau de ctre plante. n industria alimentar, culturi fungice selecionate se pot folosi la fabricarea brnzeturilor tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. n biotehnologie se pot obine compui deosebit de valoroi: antibiotice: peniciline Penicillium chrysogenum, etc.; acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); vitamine (B2, ergosterol provitamina D2); enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.). mbogirea n proteine a finurilor vegetale ageni de depoluare a apelor reziduale obinere SCP
Caractere morfologice Mucegaiurile se rspndesc n natur sub form de spori rezisteni la uscciune, form n care se menin n stare viabil ani de zile. Dac un astfel de spor ajunge pe suprafaa unui mediu favorabil pentru cretere, cu o cantitate suficient de ap liber care s-i permit absorbia substanelor nutritive, n primul stadiu care poate s dureze 3-4 ore, are loc absorbia apei i activizarea sistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale i formarea tuburilor vegetative numite hife (lat. hypha) sau thal (thallus). Hifele cresc numai prin vrf i deci au o cretere apical dup care se ramific rezultnd miceliul. Hifele se extind pe suprafaa mediului, se diversific i ndeplinesc anumite funcii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta i n profunzimea mediului realiznd absorbia nutrienilor i au rol de susinere; Hifele de rspndire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La un anumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formeaz hifele reproductoare, generatoare de spori, difereniate n funcie de gen i specie. Totalitatea hifelor vegetative i reproductoare alctuiete miceliul. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile; astfel n interval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile, difereniate. n cazul mucegaiurilor inferioare coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, au aspect pslos i culori, alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate formeaz colonii cu o cretere radial limitat i culori ce difer de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru, cu diferite nuane specifice n funcie de gen i specie. Caractere fiziologice generale sunt microorganisme aerobe deci necesit pentru cretere prezena oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat n mediul lichid. Un numr limitat de specii sunt microaerofile i pot produce mucegirea intern a untului i a oulor. se dezvolta n limite largi de pH (15-9), valoare optim n domeniu acid 5.5-6. microorganisme mezofile cu temperaturi optime de cretere la 25C, un numr restrns sunt termofile - cele patogene au temperatura optim la 37C, iar altele sunt adaptate la temperaturi sczute (0-3C). Majoritatea sunt inactivate la temperaturi de 80C; cei mai rezisteni spori sunt distrui la 88C/10 minute.
2
Muco ormuc cedo
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale) colonii dense, p sloase i o culoare ce e variaz de e la cenuiu-argintiu p n la
glbui; 2. Caractere C microscop m pice
Spora angioforii lungi i neramifica ai, de obicei perpen ndiculari pe hifa vegetativ; Spora angii sferici i; Colum mela form ma cilindric, piriform sau oval; Colar rul se ob bserv prin ruperea sau u solubilizar rea membra anei sporan ngelui i eliber rarea sporilo or; Spora angiosporii oval-cilindrici, nete ezi i hialini. 3.
Rspndire e i rol
se nt tlnete pe resturi vege etale i dejec cii. produ uce mucegirea cerealelor, pinii, a produsel lor lactate a acide, a cr rnii i prepara atelor de car rne.
Rh hizopu usstolo onifer r
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale) colonii extinse, cu u un miceliu u dens, psllos i culoar re cenuie
2.
Caractere C microscop m pice
Stilos sporangele e sferic, de d culoare b brun - neagr la maturitate; Colum mela se emisferic, cu c apofiza la arg; Spora angiosporii elibera ai prin sparg gerea spora angelui sunt t de form o oval, brun - n nchis. 3. Rspndire e i rol n nat tur, n sol i pe produs se vegetale; ; altera area fructelo or i legumelor depozita ate; produ uce mucegirea produs selor alimentare i poate e elabora m micotoxine.
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaterea mucegaiurilor i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii
Mucor mucedo
Rhizopus stolonifer
Asperg A gillusn niger
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale)
colonia se dezvo olt rapid, cu c un mice eliu catifelat t, de culoar re alb sau u albglbuie. Odat cu formarea co onidiosporilor, colonia capt un a aspect gran nular i culo oarea devine brun nchis - negru; revers sul coloniei poate fi inc color sau co olorat n galben-pal; ma arginile colo oniilor rmn albe a sau sla ab glbui. 2. Caractere C microscop m pice
Conid dioforii se dezvolta d de obicei direc ct din substr rat; Vezic cula este ma are, sferic sau globoa as; Fialid dele se dez zvolta radial pe ntreaga a suprafaa lateral a veziculei i sunt dispuse e n dou rnduri: I. Fialidele primare p sunt mai lungii dect cele secundare; II. Fialidele secundare e sunt mult m mai scurte. Fialos sporii se de ezvolta basipetal, n lan nuri lungi, d din fialidele secundare; au o form sferic s sau globoas g . 3.
Rspndire e i rol
se nt tlnete n sol, materii vegetale n descomp punere, mic croflora veg getal (tubercu uli, rdcini, , semine, fr ructe, cerea ale) i produsele lor de prelucrare,d depozite, piv vnie, sli de fabrica f ie. tulpini seleciona ate se folos sesc industr rial pentru o obinerea de acizi orga anici: acid glu uconic, galic c, citric, fuma aric, oxalic.
Aspergi illusor ryzae
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale) colonia are culoa are glbuie spre s galben n-orange, br run-oliv; revers sul coloniei este incolor r.
2.
Caractere C microscop m pice Conid dioforii sun nt nali cu pe erei subiri i aspect ru ugos, sub ve ezicul. Capu ul conidial este e sferic. Vezic cula este sfe eric i prez zint pe 2/3 din suprafa aa Fialid dele sunt un niseriate. Un neori pot fi p prezente i f fialide secun ndare. Conid diosporii su unt elipsoida ali, piriformi, sau globoi la maturita ate
3.
Rspndire e i rol
se po oate izola din sol, de pe e resturi veg getale, sem mine, n spe ecial de orez z (lat. oryzae - orez), mal fructe, pro oduse alimen ntare.
As spergi illusgl laucus s
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale) colonia are culoa are verde glbui sau verde cenuie e; revers sul coloniei este slab colorat n n nuane galb ben-verzui, brun - roc cat la
margini. 2. Caractere C microscop m pice
Conid dioforii sun nt netezi, in ncolori, cu d diametrul ca are se lrge ete treptat spre vezicul, de form oval. Capu ul conidial este e mare, sferic s sau ov val. Fialid dele se form meaz direc ct pe vezicu ul, la parte ea superioa ar. Adeseo ori pe vezicul se pot form ma noi conid diofori scuri. Fialos sporii au fo orma elipsoidal sau pir riform. 3. Rspndire e i rol
este rspndit n natura, fiind d frecvent n ntlnit n sol l. Asper rgillus glau ucus este agent de mucegire al produs selor alimentare conserv vate prin us scare (cere eale, semine oleaginoa ase, fructe uscate) sa au cu adao os de zahr (s sucuri, sirop puri, fructe confiate). c a fost t izolat de pe e pine, lapte concentra rat, unt.
Pen nicilliu umexp pansum m
1.
Caractere C macroscop m pice (colon niale) colonia are culoa are verde-alb bstrui, cu a aspect catife elat; revers sul este colo orat n brun-nchis sau portocaliu-b brun.
2.
Caractere C microscop m pice Conid dioforii au pere p i netez zi. Prezin nt fialide fie f cu form de fiol, fie cu form cilindric. Forme eaz conid dii elipsoidale, cu perei netezi.
3.
Rspndire e i rol
Penic cillium expan nsum este un mucega ai psihrofil (p poate crete e la -6C; c crete viguros la 0C). Se e dezvolt optim la 28 8C. Tempe eratura max xim de dez zvoltare est te de 35C. Este prezentat n n mod frecv vent pe me ere i pere la care pro oduce putre ezirea brun. A fost t izolat i de e pe cpuni i tomate. Foarte e rspndit pe alimente e cum sunt c carnea i pr rodusele din n carne. Produ uce micotox xine de tipul patulinei i citrininei.
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Aspergillus glaucus
Penicillium expansum
Botryt B tiscine erea
1.
forme eaz colonii extinse, floconoase. M Miceliul este iniial alb, d dar devine g gri-gri nchis pe p msura fo ormarii conidiilor. revers sul este de culoare gri. 2. Caractere C microscop m pice
Conid dioforii se formeaz din hifele aeriene, a au diferite lungimi, fie ecare purtnd d terminal un n mnunchi de ramuri scurte, s avn nd capetele rotunjite. Conid diile formate e pe aceste e ramuri scu urte sunt elip psoidale, ne etede i lung gi. 3. Rspndire e i rol
Botryt ytis cinerea se s dezvolta a n domenii de temper raturi minim me de -2 - .-5C, maxime e de 28-35C C i optime la 22-25C, , i ntr-un in nterval de p pH de 2-8. este un mucega ai ntlnit n n zonele te emperate, p pe legume (roii) i f fructe (strugur ri, mere, per re, cpuni ). poate e s produc putrezirea a fructelor i legumelor i n condiii i de refrigera are. n toa amnele nso orite produc ce "botritiza area nobila" " cu obiner rea de vinu uri de calitate superioara din boabele e stafidite.
Botrytiscinerea
Geo otrichu umcan ndidum m
1.
miceliul are culo oare alb-cre em, nlimi reduse i textura as semntoar re cu cea a drojdiilor. Pe e MEA colon niile sunt ex xtinse, au cu uloare alb, aspect pu ulverulent. revers s necolorat t 2. Caractere C microscop m pice
Prezint hife vegetative, v ramificate dichotomi ic, pe car re se dez zvolta perpend dicular hife reproductoare, care e nu se difereniaz de e hifele vege etative. Hifele e reproduc ctoare se fragmentea f az la matur ritate aproa ape n ntreg gime, formnd d arthrospo ori hialini, cilindrici c sau u elipsoidali, , cu capete rotunjite. Arthr rosporii au u tendina de aranjare e n zig-za ag, iar la m maturitate d devin sferici. 3. Rspndire e i rol
se de ezvolt la temperaturi optime o de 25-30C i m maxime de 3 35-38C. Crete slab la temperaturi t i sub 10C. este agentul a de contaminat te al produ uselor lactat te, al zemii de murtu uri, al drojdiei comprima ate. Produc ce putrezire ea acr, n special a fructelor r citrice (lmi, grapefru uit), n timp pul depozita arii acestor ra. Produce e rncezirea a untului i a altor grsimi alimentare. este contaminan c nt frecvent al a utilajelor d din industria a laptelui, m motiv pentru care a fost denumit "mu ucegaiul utila ajelor".
Alt ternar riaalte ernata a
1.
Caractere C coloniale c miceliul este puf fos, are iniial culoare alb murda ar-gri, iar ap poi devine b brun-
cenuie e. revers sul coloniei are culoare e brun pn la negru. 2. Aspect A mic croscopic
prezin nt hife sub biri, septate e. forme eaz lanuri de conidii (cca., 10 c conidii), ram mificate nere egulat, la ca aptul unor co onidiofori fo oarte scuri care nu se pot dis stinge. Con nidiile prezi int 2-3 se epturi longitud dinale, sunt piriforme i dispuse cu u partea asc cuita elong gata, spre co onidiofor. 3. Rspndire e i rol
se n ntlnete n n microflora a cerealelo or, semine elor oleagin noase proa aspt recoltat te cnd prez zena lor po oate fi considerat drep pt indice de prospeime e ale acesto ora.

Fusa ariumgrami inearu um
1.
Caractere C coloniale c
Miceliul are asp pect pslos, dens, i se extinde e rapid n p placa. Culo oarea este roz z-cenuiu spre s auriu-b brun Reversul este colorat c n portocaliu- brun cu nuane mai deschise spre margine e. 2. Aspect A mic croscopic n pre eparat micr roscopic se pot observ va: macroco onidii, car re se for rmeaz pe e conidiofo ori simpli sau ram mificai, de obicei o n mnunchi, fu usiformi, cu 5 septuri. clamidos spori, care e-sunt mono o sau pluricelulari, de e obicei globoi, formai interca alar, de-a lu ungul hifelo or sau la nivelul macro oconidiilor; sunt net tezi sau rug goi, hialini sau de culoare brun p pal. 3.
Rspndire e i rol
Se de ezvolta opti im la 24-26 6C, la pH 6 6,7-7,2. Este rspndit n natura i este fitop patogen al g gramineelo or (putrezire ea n coroana a la plante de gru, po orumb). Se po oate ntlni si pe plant te (mazre, , cartofi, ba anane). Poate e elabora micotoxine m de d tipul scir rpene (zear ralenone).
Clad dospori iumhe erbaru um
1.
Caractere C coloniale c colonii catifelate, netede uor o ridate, de e culoare oliv. revers s de culoare e brun oliv pn p la neg gru-bleumar rin (ca o pat t de cerne eal).
2.
Aspect A mic croscopic prezin nt hife sub biri, septate e. Conid dioforii su unt ramifica ai neregula at, ceea c ce le conf fer un as spect
dendritic. forme eaz conid dii elipsoid dale pn la cilindric ce, cu ex xtremiti uneori neregul late datorita a cicatricilor r mugurale. Conidiile sunt de obic cei neseptat te, dar cele mari pot prez zenta 1-2 se epturi transversale. 3. Rspndire e i rol
se po oate dezvolt ta pn la un u aw de 0. .88 i ntr-un domeniu de tempera atura cuprins ntre -1-0C C i 32C. este un u contamin nant frecvent al produs selor alimen ntare, este ntlnit pe c came i produ use din carn ne, oua, legume proasp pete, alune, cereale. produ uce pete negre pe carn nea pstrat, n condiii i de refriger rare.
Botrytis cinerea
Geotrichum candidum
Alternaria alternata
Fusarium graminearum
Cladosporium herbarum
TEHNICI DE IZOLARE A CULTURILOR PURE

Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operaii de prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare n medii de cultur specifice i, dup cultivare n condiii optime, izolarea i studiul coloniilor izolate, repicare pentru obinerea de culturi pure.
Prin cultur pur se nelege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril cu volum limitat. Astfel, o cultur pur este format din celule aparinnd unei singure specii sau unei singure tulpini.
In funcie de principiul realizrii lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate n dou grupe mari, i anume: metode bazate pe principiul separrii fizico-mecanice a celulelor; metode biologice.
La rndul lor, fiecare din aceste dou grupe cuprinde metode generale, care se preteaz a fi utilizate pentru izolarea majoritii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru un anumit grup sau un microorganism individual. Procedee fizice de izolare a culturilor pure Metoda Koch Se bazeaz pe rspndirea microorganismelor recoltate din medii naturale ntr-un mediu nutritiv i fixarea distanat a celulelor n urma solidificm mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate ntre ele. Metoda este folosit n special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de rspndire este mustul de mal cu gelatin, repartizat cte 20cm3 n 3 eprubete, fluidificat i meninut la 35-40C. Din proba aleas pentru izolare se recolteaz celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecut succesiv n cele 3 eprubete. Dup inoculare i uniformizare, coninutul fiecrei eprubete se repartizeaz n cte o plac Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care rmn fixate n gel vor forma prin multiplicare colonii izolate. n funcie de densitatea celulelor recoltate iniial, n placa a 2 a sau a 3 a pot exista colonii izolate (la o distan de cca. 2 cm), iar dup studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea n eprubete cu Malt Extract Agar, obinndu-se culturi pure (fig. 1).
1
a tiina i Ing gineria Alimen ntelor Facultatea
Fig g. 1. Tehnic ca de izolare e a culturilo or pure Metoda scarificat n plci Petri P sterile e se repartiz zeaz mediul de cultur r adecvat ( (BCA sau M MMA) (fig. 2 2).
Fig. 2 Repartiz zare mediu d de cultur a adecvat Cu ajuto orul firului metalic m se recolteaz celule din mediul nat tural sau d din culturi m mixte (fig. 3), apoi cu firu ul ncrcat cu celule se s traseaz striuri dife ferite pe suprafaa med diului solidifica at, astfel nc ct prin drum mul ct mai i sinuos par rcurs de fir (Fig.4), ntr r-o zon a plcii celulele s rmn ataate de e mediu i prin termo ostatare 48-72 h s se e dezvolte i s formeze colonii izola ate.
a tiina i Ing gineria Alimen ntelor Facultatea
Fig g. 3 Recoltar rea celulelo or din cultur ri mixte Se realiz zeaz apoi studiul s morf fologic al co oloniilor repr rezentative i culturile c care interes seaz sunt repicate n epru ubete cu me ediu steril, ob o inndu-s se astfel cult turi pure (fig g. 5).
Fi ig. 4 Trasar re striuri pe e suprafaa unui mediu solidificat
Fig. 5 Obin nere de cult turi pure
TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A NUMRULUI DE MICROORGANISME

Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense
Metoda culturala Koch
Metodologia de analiz presupune inoculare n masa mediului solidificat, cnd 1 cm3 din fiecare diluie se transfer cu cte o pipet steril n plci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare plac se repartizeaz cte o eprubet de mediu de cultur specific, cu agar (10-15 cm3), fluidificat i temperat. Mediul se omogenizeaz cu suspensia din plac prin micri orizontale, circulare ale plcii. Dup solidificarea mediului, prin termostatare n condiii optime, se vor forma colonii att la suprafaa mediului ct i n profunzimea acestuia.
Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe, dar i microorganismele aerobe le tolereaz destul de bine. n cazul microorganismelor anaerobe se recomand cultivarea n dublu strat, adic dup nglobarea celulelor n mediu i solidificare, primul strat de mediu se acoper cu nc un strat de mediu steril.
Citirea i interpretarea rezultatelor Dup termostatarea n condiii optime, apariia vizibil a coloniilor va depinde de particularitile fiziologice ale microorganismelor cultivate i de condiiile de cultivare, de obicei dup 48-72 h de cultivare. n funcie de numrul de colonii evideniate n plcile din care s -a fcut numrarea n, se va calcula numrul de microorganisme pe gram sau cm 3 prob de analiz, cu formula:
N numrul de celule/cm3(g) prob; n suma numrului coloniilor din plcile din care se face numrarea; x1 numrul plcilor din prima diluie aleasa pentru numrare; x2 - numrul plcilor din a doua diluie aleasa pentru numrare; k coeficientul de diluie corespunztor primei diluii aleas pentru numr are; 0,1 coeficient care egaleaz diluiile.
Atenie!!! Numrarea se realizeaz din plcile Petri n care s-au dezvoltat ntre 25 250 de colonii
n cazul n care numrul de colonii pe plac este mare, n imposibilitatea repetrii analizei, pentru a nlesni numrarea fie se mparte placa n mai multe sectoare, se numr coloniile pe un sector i, n final, se nsumeaz coloniile pe ntreaga plac, fie se delimiteaz pe reversul mediului o suprafa de 1 cm2, care conine un numr mediu de microorganisme, se numr coloniile de pe aceast suprafa i, n final, se raporteaz la total suprafa mediul din plac.
Tema: TEHNICI INDIRECTE MICROORGANISME
(CULTURALE)
DE
EVALUARE
NUMRULUI
DE
Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare evalurii numrului de microorganisme 1. Completai schema de lucru pentru realizarea diluiilor si inocularea probelor
2. nregistrai in tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (in plcile selectate pentru numrare) Proba Nr. colonii/plac Diluia 1 2 3. Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________
NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data
Cadrul didactic
METODA DIRECT DE NUMRARE A BACTERIILOR N PREPARATE FIXATE I COLORATE METODA BREED

Celulele de bacterii aflate ntr-un volum cunoscut de lichid se repartizeaz pe o suprafa limitat de frotiu, iar dup fixare i colorare simpl se stabilete numrul de celule prin examen microscopic direct. 2-6 cm (a).
2
Pe o lam de sticl degresat se contureaz cu markerul o suprafa Sd de
Se inverseaz lama i, central, cu ajutorul unei micropipete sterile, se plaseaz o pictur din suspensia de analizat cu un volum cunoscut Vp, egal cu 0.02-0.05 cm3 (b). Imediat cu ajutorul firului se repartizeaz cantitatea de prob ct mai uniform, pe ntreaga suprafa conturat.
Se realizeaz uscarea n curent de aer cald (c, d), fixarea (de preferat cu soluie de alcool 96%, timp de 20 min) (e), colorarea simpl (f), splarea (g) i uscarea.
1
Preparatul se studiaz apoi la microscop, cu obiectiv de imersie, avnd grij ca pictura de ulei de cedru s fie pus n momentul n care se face numrarea. Se numr celulele de bacterii din mai multe cmpuri microscopice (minimum 25; n=600-1000) aflate n diferite zone ale frotiului. Dup numrare; se
calculeaz numrul mediu de celule pe cmp microscopic (x = numrul de cmpuri cercetate):
Pentru determinarea numrului de celule prezente ntr -un gram sau cm3 produs analizat este necesar s se cunoasc: gradul de diluie, volumul de suspensie folosit la obinerea frotiului, mrimea suprafeei delimitate pe care s -a realizat frotiul i suprafaa cmpului microscopic. Suprafaa cmpului microscopic Sc se determin cu ajutorul micrometrului obiectiv. Se nlocuiete preparatul analizat cu lama micrometrului obiectiv i, cu acelai obiectiv cu care s-a fcut numrarea, se msoar diametrul cmpului dc cu ajutorul scrii gradate (1 mm:100 diviziuni): unde: nd este numrul de diviziuni de pe scara micrometrului obiectiv care se cuprind exact n cmpul microscopic:
Numrul de cmpuri microscopice posibil de studiat pe suprafaa de frotiu delimitat - Nc se calculeaz cu formula:
Numrul de bacterii prezente ntr-un cm3 sau un g produs analizat se determin cu formula: n care: k este coeficientul de diluie.
Tema: METODA DIRECT DE NUMRARE A BACTERIILOR N PREPARATE FIXATE I COLORATE - METODA BREED Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare evalurii numrului de microorganisme 1. nregistrai datele obinute n tabelul de mai jos:
Suprafaa delimitat, cm2 Volumul suspensiei de analizat, cm3 Numrul mediu de celule pe cmp microscopic:
x (numrul de cmpuri cercetate) n (nr. celulele de bacterii) x (numrul de cmpuri cercetate) n (nr. celulele de bacterii)
Sd = Vp =
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
dc = Sc =
Diametrul cmpului microscopic, mm Suprafaa cmpului microscopic, cm2
Numrul de cmpuri microscopice pe suprafaa de frotiu delimitat
Nc =
Numrul de bacterii prezente ntr-un ml sau un g
N=
NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data Cadrul didactic
METODE DIRECTE DE NUMRARE NUMRAREA CU CITOMETRE

Celulele de drojdii i sporii de mucegai se pot numra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor (camerelor de numrat) . Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Trk, Brker, Rosenthal, Goreaev .a., construite pe acelai principiu. Un citometru este o lam de sticl groas, prevzut cu trei platforme separate ntre ele prin rigole n sticl. Platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu o nlime de 0,1- 0,2 mm (nscris pe fiecare camer). Pe platforma central este gravat o reea de linii perpendiculare, care delimiteaz o anumit suprafa divizat de ctre linii perpendiculare n microcelule de form ptratic (ptrele elementare). Diferenierea dintre tipurile de citometre const n mrimea variabil a suprafeei unui ptrel elementar, n cazul citometrului Thoma, suprafaa de 1 mm2 este divizat de ctre linii n 400 de ptrele elementare cu (Fig. 1) latura de 1/20 mm.
Fig. 1 Profilul i reeaua citometrului Thoma

1
Pentru numrare se plaseaz o pictur din suspensia de celule de analizat pe platforma central, n dreptul suprafeei delimitate. Peste suspensie se plaseaz o lamel care se sprijin pe cele dou platforme laterale i astfel ntre lamel i citometru se creeaz o pelicul de lichid cu nlime egal cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm).
Preparatul obinut se studiaz la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, cnd n cmpul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 ptrele elementare, din care se numr celulele a cror suprafa se afl mai mult de jumtate n interiorul careului de 4x4 ptrele elementare. Se fac numrri de celule din mai multe cmpuri microscopice (n = 100) i se calculeaz numrul mediu de celule pe un ptrel elementar. Suprafaa (S) de 1 mm2 este divizat de ctre linii n 400 de ptrele elementare cu latura de 1/20 mm. Suprafaa ptrelului elementar este:
nlimea platformei centrale:
Volumul ptrelului elementar:
Numrul mediu de celule pe un ptrel elementar: Numrul de celule prezente ntr -un cm3 de suspensie de analizat se determin cu formula:
n care: n - numrul mediu de celule pe un ptrel elementar; k - coeficient de diluie. n cazul bacteriilor, aceast metod este greu de aplicat, att din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor ct i a faptului c de multe ori ele prezint mobilitate.
Tema: METODE DIRECTE DE NUMRARE NUMRAREA CU CITOMETRE Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare evalurii numrului de microorganisme 1. Analizai profilul i reeaua citometrului Thoma
2. nregistrai datele obinute n tabelul de mai jos:

Suprafaa ptrelului elementar, mm 2 Spe =
nlimea platformei centrale, mm
h=
Volumul ptrelului elementar, cm 3
Vpe n (nr. celulele )
Numrul mediu de celule pe un ptrel elementar: x (numrul de cmpuri n (nr. x (numrul de cmpuri cercetate) celulele ) cercetate) 1 6 2 7 3 8 4 9 5 10 Numrul de celule prezente ntr-un cm3 de suspensie
N=
NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data Cadrul didactic
INFLUENA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA DEZVOLTRII MICROORGANISMELOR

n procesul de nutriie i deci n cel de dezvoltare a microorganismelor, acestea sunt supuse influenelor unor factori de mediu care condiioneaz activitatea microbian determinnd fie stimularea creterii i reproducerii, fie inhibarea activitii (inactivarea microorganismelor).
Procesele metabolice se desfoar n limite stricte de temperatura, specifice fiecrui microorganism. Factorul temperatur poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar n anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora.
Modul de lucru Pentru a testa influena temperaturii asupra dezvolt rii microorganismelor se folosesc dou microorganisme test (Bacillus subtilis i Saccharomyces cerevisiae), sub form de suspensie. Pentru fiecare microorganism luat n studiu, se iau cte trei plci Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc n fiecare plac, cate 1 cm3 suspensie. n fiecare plac Petri se toarn apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA bulion de carne cu agar, pentru Bacillus subtilis i MMA must de mal cu agar, pentru Saccharomyces cerevisiae) fluidificat i rcit la 455C. Mediile se repartizeaz uniform n plci prin rotirea acestora n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea. Pe capacul plcilor se noteaz numele probei, mediul utilizat i apoi se termostateaz la temperaturi de 4, 25, 37C, timp de 3 zile. Dup perioada de termostatare se va evalua creterea microorganismelor n fiecare plac i se va nota nivelul de cretere, n tabelul din fisa de lucru.
Pentru a aprecia dezvoltarea microorganismelor sau activitatea enzimelor este necesar s se cunoasc valoarea activitii apei.
Disponibilitatea apei dintr-un mediu de cultur pentru transferul de substane i reaciile chimice este exprimat prin activitatea apei (aw). Acest parametru ia valori de la 0 la 1. Prezena substanelor solubile n apa face ca activitatea apei pure s scad sub valoarea 1. Cu ct concentraia unei soluii este mai mare, cu att scderea valorii activitii apei este mai mare i vice-versa, ceea ce poate crea un soc osmotic.
Mod de lucru Pentru a testa influena temperaturii asupra dezvolt rii microorganismelor se folosesc dou microorganisme test, Bacillus subtilis i Saccharomyces cerevisiae, sub form de suspensie i medii de cultura cu concentraii diferite de sare (0%, 0.5%, 2% NaCl)/ diferite activiti ale aw. Pentru fiecare microorganism luat n studiu, se iau cte trei placi Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc n fiecare plac, cate 1 cm3 suspensie. n fiecare plac Petri se toarn apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA bulion de carne cu agar pentru Bacillus subtilis i MMA must de mal cu agar pentru Saccharomyces cerevisiae) fluidificat i rcit la 455C. Mediile se repartizeaz uniform n placi prin rotirea acestora n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea. Pe capacul plcilor se noteaz numele probei, mediul utilizat, concentraia de sare i apoi se termostateaz la temperatura de 25C timp de 3-5 zile plcile inoculate cu suspensie de Saccharomyces cerevisiae i temperatura de 37C, timp de 48 ore, plcile inoculate cu suspensie de Bacillus subtilis. Dup perioada de termostatare se va evalua creterea microorganismelor n fiecare plac i se va nota nivelul de cretere n tabelul din fisa de lucru.
Tema: FACTORI MICROORGANISMELOR
CARE
INFLUENEAZ
DEZVOLTAREA
Scopul: nelegerea modului n care diveri factori influeneaz dezvoltarea microorganismelor 1. Influena temperaturii asupra dezvoltrii microorganismelor
Notai n tabel nivelul de cretere a microorganismelor dup termostatare la diferite temperaturi.
MICROORGANISM 4C Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae
++ cretere maxim + cretere medie - cretere nul
TEMPERATURA 25C 37C
2. Influena activitii apei asupra dezvoltrii microorganismelor

Notai n tabel nivelul de cretere a microorganismelor dup inoculare pe medii de cultura cu concentraii diferite de NaCl si valori diferite ale activitii apei.
MICROORGANISM 0% Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae
++ cretere maxim + cretere medie - cretere nul
Concentraie NaCl/aw 0,5%
2%
NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data
Cadrul didactic

Laborator Microbiologie Generala - 2011-2012

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Laborator Microbiologie Generala - 2011-2012

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE GENERALA

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

REGULI DE PROTECIE A MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor