DETERMINAREA HEMOGLOBINEI ŞI A UNOR PRODUŞI

DE METABOLISM AI HEMOGLOBINEI

Introducere
Metodele de determinare a hemoglobinei pot fi grupate astfel:
Metode spectrometrice de absorbţie bazate pe măsurarea directă a oxihemoglobinei sau a
hemoglobinei reduse sau după ce în prealabil a fost convertită într-un derivat colorat
stabil ca: hematină hidroclorică, hemoglobină, carboxihemoglobină etc.
Metode gazometrice prin saturarea hemoglobinei cu un gaz (oxigen, oxid de carbon) şi
evaluarea cantităţii de hemoglobină din cantitatea de gaz fixată.
Metode bazate pe determinarea fierului hemoglobinic. Hemoglobina conţine o cantitate
definită de fier (0,338%), lucru care permite un calcul exact al cantităţii de hemoglobină.
Din toate acestea prezintă o serie de avantaje şi se recomandă ca metodă standard
de către Comitetul Internaţional pentru Standardizare în Hematologie (ICSH), procedeul
de determinare după transformarea hemoglobinei în cianmethemoglobină. Aceasta este
deosebit de stabilă, are un maxim larg de absorbţie în jur de 540 nm, se respectă legea
Lambert-Beer, reacţia nu este interferată de proteinele plasmatice sau de bilirubină şi
cuprinde practic toţi derivaţii hemoglobinici din sânge (oxi-Hb, Hb redusă, carboxi-Hb,
met-Hb), care pot fi integral convertiţi în cianmethemoglobină.
Partea experimentală
1. Determinarea hemoglobinei ca cianmethemoglobină
Principiu
Hemoglobina este transformată în cianmethemoglobină prin tratare cu fericianură
de potasiu şi cianură de potasiu, iar absorbţia de lumină a soluţiei de cianmethemoglobină
se măsoară la 540 nm.
Reactivi
Reactiv Drabkin: 50 mg cianură de potasiu, 1 g bicarbonat de sodiu şi 200 mg fericianură
de potasiu se dizolvă în apă distilată şi se aduce volumul la 1000 ml cu apă distilată. pH-
ul soluţiei se ajustează la 7,2 - 7,4.
Standard de cianmethemoglobină (preparate comerciale). Detalii privind concentraţia
standardului şi modul de lucru sunt furnizate împreună cu preparatul respectiv. Soluţiile
se păstrează timp de un an la + 4C.
Mod de lucru
Se pipetează 0,02 ml sânge (pipetă Sahli) în 5 ml reactiv Drabkin, iar după 20 de
minute se măsoară absorbţia la 540 m faţă de reactivul Drabkin. Nivelul hemoglobinei
exprimat în grame/100 ml de sânge se obţine dintr-o curbă de etalonare trasată cu ajutorul
standardului.
Observaţii: Metoda aceasta detectează toate formele de hemoglobină şi permite
determinări foarte precise şi exacte. Necesită însă un standard de cianmethemoglobină,
iar reactivul Drabkin conţinând cianură este foarte toxic. Calcularea conţinutului de
hemoglobină în grame/100 ml se poate efectua şi fără curbă de calibrare măsurându-se de
fiecare dată absorbţia probei de analizat cât şi absorbţia unei soluţii standard.
Calcul
E Proba 5,02 1
 CS  
grame hemoglobină/100 ml = E Standard 0,02 1000

1
 E Proba
 C S  0,251
grame hemoglobină/100 ml = E Standard

unde Cs este concentraţia standardului în mg%. În lipsa unui standard de

cianmethemoglobină se poate calcula conţinutul în hemoglobină pe baza coeficientului
molar de absorbţie ( = 11103) şi a masei moleculare a hemoglobinei (16144).
E Proba 16114 5,02
10 1   E Proba  36,8
grame hemoglobină/100 ml = 11000 0,02
Acest ultim mod de calcul este permis numai atunci când se dispune de un
spectrofotometru cu o mare putere de rezoluţie. Coeficientul de 36,8 trebuie verificat în
fiecare laborator utilizând probe de sânge al căror conţinut în hemoglobină a fost
determinat cu exactitate pe baza comparării cu un standard de cianmethemoglobină.
Valori normale
Bărbaţi: 14 – 18 g hemoglobină/100 ml sânge.
Femei: 12 - 16 g hemoglobină/100 ml sânge.
Semnificaţia clinică
Hemoglobina scade în: anemii, LES, boală Crohn, insuficienţa renală cronică,
glomerulonefrită cronică, hemoglobinuria paroxistică nocturnă, hiperhidratare, infiltraţia
şi supresia măduvei osoase.
Hemoglobina creşte în: deshidratare, poliglobulie, policitemia vera, AVC, tumori
cerebrale, encefalită.
2. Determinarea bilirubinei serice
Bilirubina provine din catabolismul hemului din hemoproteine.
Bilirubina din sânge este prezentă sub trei forme: neconjugată, conjugată şi legată
covalent de albumină. Aceste forme au solubilitate diferită în apă şi abilităţi diferite de a
reacţiona chimic. Bilirubina neconjugată are o solubilitate mică în apă în timp ce celelalte
fracţiuni sunt mult mai solubile.
Bilirubina serică dă reacţii lente şi rapide şi că reacţiile lente pot deveni rapide în
prezenţa unor acceleratori adăugaţi la amestecul de reacţie. Fracţia de bilirubină care
reacţionează direct şi rapid în absenţa unui accelerator este cunoscută sub denumirea de
bilirubină directă iar cea care necesită un "accelerator" pentru ca reacţia să devină rapidă
este cunoscută sub denumirea de bilirubină "indirectă". În fapt acceleratorul solubilizează
bilirubina neconjugată şi creşte disponibilitatea ei de a interacţiona.

Bilirubina directă este bilirubina conjugată uşor solubilă şi fracţia delta iar fracţia
indirectă o reprezintă bilirubina neconjugată. Când bilirubina reacţionează în prezenţa
unui accelerator, bilirubina determinată este bilirubina totală. Prin determinarea
bilirubinei totale şi a celei directe se poate calcula bilirubina neconjugată (indirectă) prin
scădere
Bilirubina totală - bilirubina conjugată = bilirubina neconjugată
În marea lor majoritate metodele de determinare a fracţiunilor bilirubinei au la
bază reacţia bilirubinei cu săruri de diazoniu.. Metodele bazate pe aceste reacţii diferă
între ele în funcţie de pH-ul la care se realizează.
Bilirubina conjugată este hidrosolubilă şi reacţionează direct cu acidul sulfanilic
diazotat. De aceea se numeşte curent bilirubină directă.

2
 Bilirubina liberă este insolubilă în apă şi este transportată prin fixare pe albumina
serică. Ea nu reacţionează direct cu reactivul diazo (bilirubină indirectă). Reacţia este
posibilă numai după adausul de acceleratori (alcooli, cofeină, uree etc.), care permit
dezvoltarea culorii pe seama ambelor componente (directă şi indirectă) reprezentând de
fapt bilirubina totală.
Hemoliza conduce la valori fals scăzute din cauză că în multe determinări creşte
absorbanţa probei martor. Serurile lipemice dau valori fals crescute din cauza efectului de
turbiditate. Bilirubina este distrusă de lumină şi căldură, aspecte de care trebuie ţinut
seama atunci când se fac determinări.
Metoda Jendrassik-Grof modificată
(varianta cu cofeină, acetat şi benzoat de sodiu)
Această metodă se bazează pe determinarea bilirubinei directe şi totale cu ajutorul
factorului calculat pe baza coeficientului molar de absorbţie a colorantului azoic la
lungimi de undă diferite, fără utilizarea de standarde.
Principiu
Bilirubina formează cu acidul sulfanilic diazotat un colorant azoic a cărui
absorbţie de lumină este proporţională cu conţinutul în bilirubină. Bilirubina conjugată
reacţionează direct cu acidul sulfanilic diazotat (bilirubina directă), iar bilirubina totală se
determină după adausul unui accelerator şi a unei soluţii alcaline de sare Seignette.
Bilirubina indirectă (neconjugată) se determină prin calcul din diferenţă.
Reactivi
Acid sulfanilic 2,9·10-2 M, acid clorhidric 0,17 N (5 g de acid sulfanilic se dizolvă în
apă, se adaugă 15 ml acid clorhidric concentrat şi se completează cu apă până la 1000
ml).
Soluţie de azotit de sodiu 7,2·10-2 M (0,5 g azotit de sodiu se dizolvă în 100 ml apă
distilată). Se conservă timp de o lună la +4C.
Accelerator: a) cofeină 1,3 · 10-1 M, benzoat de sodiu 1,56 · 10-1 M (se dizolvă 10 g
cofeină şi 15 g benzoat de sodiu în 100 ml apă); b) acetat de sodiu 25% în apă distilată.
Acceleratorul se prepară extemporaneu amestecând în volume egale soluţiile a şi b.
Soluţie Fehling II: tartrat de sodiu şi potasiu 9,3·10-1 M, NaOH 1,9 N (se dizolvă 150 g
sare Seignette în aproximativ 600 ml apă, se adaugă 300 ml soluţie NaOH 25% şi se
completează cu apă distilată la 1000 ml).
Clorură de sodiu, soluţie 0,9%.
Mod de lucru
Determinarea se efectuează în patru eprubete 160/16 mm notate PT (probă total),
MT (martor total), PD (probă directă) şi MD (martor direct) în care se pipetează în
ordine:

Bilirubină totală Bilirubină directă

Reactivii PT MT PD MD
Acid sulfanilic sol. ml 0,20 0,20 0,20 0,20
Azotit de sodiu 1 pic - 1 pic -
Accelerator ml 1,00 1,00 - -
Clorură de sodiu ml - - 2,00 2,00
Ser ml 0,20 0,20 0,20 0,20
Se agită eprubetele şi se Se agită probele, se lasă la

3
 lasă în repaus la temperatura camerei exact 5
temperatura camerei 10-60 minute după care se
de minute măsoară absorbţia (ED) la
546 nm faţă de martor, în
cuvă de un cm
Soluţia Fehling II ml 1,00 1,00
După 5-30 minute se
măsoară absorbţia probei
(ET) faţă de martor la 578
nm, în cuva de un cm

Calcul
mg bilirubină totală/100 ml ser = ET x 11,3
mg bilirubină directă/100 ml ser = ED x 14,6
bilirubină indirectă = bilirubină totală - bilirubină directă
Interferenţe:
Hemoliza conduce la valori fals scăzute din cauză că în multe determinări creşte
absorbanţa probei martor.
Serurile lipemice dau valori fals crescute din cauza efectului de turbiditate.
Bilirubina este distrusă de lumină şi căldură, aspecte de care trebuie ţinut seama atunci
când se fac determinări.
Valori normale
Adulţi:
0,3 - 1,0 mg/dl bilirubină totală
până la 0,3 mg/dl bilirubină directă.
Copii:
ziua 1 - până la 8 mg /dl;
ziua 2 - până la 12 mg /dl;
zilele 3-10 - până la 20 mg /dl;
după o lună- până la 1,5 mg /dl.
Semnificaţia clinică
Bilirubina directă creşte în:
cauze hepatocelulare: hepatită, ciroză, leziuni toxice, infecţii severe, insuficienţă cardiacă
dreaptă;
cauze colestatice: ficat gras, abces hepatic, tumori hepatice, sarcină, icter obstructiv;
cauze medicamentoase: indometacina, metildopa, tetraciclina, fenotiazine, estrogeni,
steroizi anabolizanţi, citostatice, tuberculostatice.
(icterul devine vizibil când bilirubina totală > 2mg%)
Bilirubina indirectă creşte în:
Cauze hemolitice: anemie hemolitică, resorbţia hematoamelor, infarct pulmonar,
hemoragie intestinală, policitemia vera, hiperbilirubinemia de şunt.
Cauze hepatocelulare: hepatită, ciroză, leziuni toxice, infecţii severe, insuficienţă
cardiacă dreaptă, icter juvenil intermitent, hipertiroidie, şunt portocav, rifampicină,
steroizi;
Cauze colestatice: ficat gras, abces hepatic, tumori hepatice, sarcină, icter obstructiv (dar
mult mai puţin decât bilirubina directă).

4
5