INTRODUCERE N HISTOCHIMIE I

IMUNOHISTOCHIMIE
Partea a III-a

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CRAIOVA

PLANUL PREZENTRII

Metode de blocare a surselor de semnal fals in

IHC

Detectia fluorescenta a semnalului

PLANUL PREZENTRII

Metode de blocare a surselor de semnal fals in

IHC

Detectia fluorescenta a semnalului

Secvena tipic a IHC

Secionare a blocului de parafin
Clarificare (solveni organici)
Hidratare (alcool n concentraie descresctoare)
Splare n ap
Blocarea enzimelor endogene
Splare n sol. salin
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Blocarea biotinei endogene
Incubare cu primul anticorp
Splare n sol. salin
Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie
Detecia semnalului
Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza Peroxidazele contin gruparea HEM ce utilizeaza H2O2
ca acceptor de electroni pentru a cataliza oxidarea
substratului (DAB, AEC).
Peroxidaza exogene extrasa din hrean.
Peroxidazele endogene:

Hemoglobina (hematii)
Mioglobina (tesut muscular)
Citocromi (granulocite, monocite)
Catalze (ficat, rinichi)

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Hemoragie cu reactie nespecifica.

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Blocarea enzimelor endogene

-PeroxidazaBlocarea peroxidazei endogene se face prin
suprasaturare cu H2O2 1-3% in apa distila
sau metanol.

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Blocarea enzimelor endogene

-Peroxidaza-

Blocarea enzimelor endogene

-Fosfataza alcalina PA (intestin de vitel) muta o grupare P de pe un
donor pe un acceptor (ambele componente ale
substratului).
PA endogena se gaseste in maduva hematogena,
vezica urinara si intestin.
Blocarea PA se face cu o solutie 5 mM de levamisol.

Blocarea enzimelor endogene

-Fosfataza alcalina-

Blocarea biotinei endogene

Biotina abunda in ficat, rinichi si tesutul limfoid.
Vizualizarea biotinei endogene se acentueaza pe
sectiunile tratate cu EDTA pH=9.

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Blocarea biotinei endogene

Biotina poate lega o singura data Avidina sau Streptavidina !!!

Blocarea biotinei endogene

Incubare cu streptavidina
Spalare PBS
Incubare cu biotina
Spalare PBS

Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

Se realizeaz pentru mpiedicarea legrii nespecifice
a anticorpului primar care ar conduce la obinerea
unui semnal fals.
Inainte de anticorpul primar, se incubeaz lamele 30
min la temperatura camerei cu ser normal al
aceleiai specii cu anticorpul secundar, sau cu lapte
degresat 1-3%.
Nu se spala in PBS inainte de adaugarea anticorpului
primar.

Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

Secvena tipic a IHC

Secionare a blocului de parafin
Clarificare (solveni organici)
Hidratare (alcool n concentraie descresctoare)
Splare n ap
Blocarea enzimelor endogene
Splare n sol. salin
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Blocarea biotinei endogene
Incubare cu primul anticorp
Splare n sol. salin
Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie
Detecia semnalului
Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela

PLANUL PREZENTRII

Metode de blocare a surselor de semnal fals in

IHC

Detectia fluorescenta a semnalului

Detectia fluorescenta a semnalului

Anticorpii se conjuga cu fluorofori (cromofori) care excitati
cu o lumina UV de o lungime de unda, pot emite o lumina UV
cu energie mai joasa (cu o lungime de unda mai mare).

Detectia fluorescenta a semnalului

(in lumina reflectata!!!)

Detectia fluorescenta a semnalului

Fluoroforii sunt de obicei compusi fenolici:
Cei mai folositi: FITC (verde), Texas Red, CY3 (rosu),
DAPI (albastru)

In ultimii ani au aparut nanocrostale care emit lumina pe

frecvente ce depind de dimensiunile lor (nanocristale- Qdots)

Detectia fluorescenta a semnalului

Detectia fluorescenta a semnalului

Detectia fluorescenta a semnalului

Avantajele IHC in fluorescenta:
1. Studiile de colocalizare sunt posibile numai prin fluorescenta.
2. Microscopia confocala si deconvolutia permit colocalizarea si
reconstructia 3D reale.
3. Detectia nu interfera cu structurile normale (semnal pur).
4. Markerii fluorescenti se pot urmari si in vivo.
Dezavantaje:
1. Microscop special dotat cu filtre pentru fiecare cromogen.
2. Vizualizarea nespecifica a unor compusi fluorescenti
(lipofuscina).

Detectia fluorescenta a semnalului

Detectia fluorescenta a semnalului

Detectia fluorescenta a semnalului

CD31 Alexa 488

CD31 Alexa 488

Cd20cy Alexa 594

Cd20cy Alexa 594

Planuri optice reale

Deconvoluie