ARBORELE GENEALOGIC

Metoda intocmirii arborelui genealogic (pedigreeul) consta in efectuarea unei diagrame familiale
care cuprinde istoria si insusirile ascendentilor,
descendentilor si colateralilor familiei analizate.
Ca importanta diagnostica, metoda serveste la :
- delimitarea unei malformatii congenitale
neereditare de o boala ereditara propriu zisa
- stabilirea tipului de transmitere a bolii ereditare
Metoda arborelui genealogic consta in trei etape :
datele genealogice ( ancheta medico biologica
familiala)
inregistrarea genealogica ( intocmirea arborelui)
analiza genealogica ( stabilirea tipului de
transmitere)

Datele genealogice
Se obtin pe baza unui chestionar complet si apoi se
inregistreaza pe fise individuale, dupa care se
centralizeaza in fisa de ancheta medico biologica
familiala.
Punctul de plecare il constituie un subiect denumit
probant (caz index sau caz primar), care este
purtatorul unui caracter pentru care se doreste
stabilirea incidentei lui familiale.
In fisa personala a probandului se consemneaza toate
elementele ce pot servi pentru interpretarea genetica.
De ex, la nivelul viscerocraniului pot fi consemnate :
implantarea parului, radacina nasului, planul de
implantare a pavilionului urechii, coloratia irisului,
dentitia diforma, prognatismul mandibular etc.
Examenul somatic este completat cu analize genetico
biologice ca : radiografii, EEG, EKG, cariotip,
cromatina sexuala, dermatoglife etc. Se vor consemna
toate observatiile obstreticale cu privire la proband.

Dupa intocmirea fisei probandului se trece la

intocmirea fiselor membrilor filiatiei directe si apoi
colateralilor probandului.

Datele genealogice ce constituie ancheta medico

biologica familiala sunt reprezentate grafic, cu
ajutorul semnelor conventionale, rezultand arborele
genealogic.

Analiza genealogica are la baza stabilirea tipului de

transmitere a caracterului patologic urmarit:
- autozomal dominanta
- autozomal recesiva
- legata de cromozomii sexuali

SFATUL GENETIC

Sfatul genetic reprezinta un ansamblu de masuri care

se iau in vederea inlaturarii sau limitarii raspandirii
bolilor genetice in populatia umana.
Sfatul genetic este solicitat in urmatoarele
circumstante:
Cuplul doreste copii, iar unul dintre parteneri are o ruda
apropiata care sufera de o boala ereditara.
Unul dintre parinti are deja un copil cu un defect grav
din nastere.
Femeia a avut deja unul sau mai multe avorturi
spontane. Problemele severe ale cromozomilor
fetusului pot duce uneori la pierderea sarcinii. Pierderile
repetate ale sarcinii pot indica o problema genetica.
Femeia a nascut deja un copil mort, care prezenta
semnele fizice ale unei boli genetice. Multe boli
genetice grave produc anomalii fizice care dau copilului
afectat un aspect specific.

daca partenerii cuplului prezinta un anumit grad de

inrudire ( legatura consagvina);

daca femeia are peste 35 de ani, i se recomanda in

timpul sarcinii sa faca amniocenteza in vederea
stabilirii unui diagnostic prenatal , luand in
consideratie ca riscul bolilor cromosomiale cresc
odata cu virsta femeii;

daca in perioada timpurie a graviditatii mama a primit

medicamente, a trecut chimioterapia sau a fost
supusa radiatiei sau a altor factori chimici nocivi;

Obiectivele principale ale sfatului genetic sunt acelea de

a stabili riscul pe care-l intampina un individ sau cuplu
de a avea descendenti afectati de o boala ereditara.

Exista mai multe metode de diagnosticare a

maladiilor:

Clinico-genealogica - colectarea informatiei

completa da la persoana in cauza (date despre
parintii, frati, surori, buneii, rudele apropiate: ce
maladii au suportat).

Metoda citogenetica consta in cercetarea

garniturii normale de cromosomi si al anomaliilor de
numar si de structura a cromosomilor. De
asemenea aceasta metoda include determinarea
cromatinei sexuale. Pentru aceste analize, se
colecteaza singe, sau celulele maduvei osoase, a
pielii, a lichidului amniotic, tesuturilor embrionale.

Metoda molecularo-genetica. Permite

determinarea modificarilor structurale si
functionale din acizii nucleici in patologia
ereditara. Se extrage probele de ADN din singele
periferic, din vilozitatile corionale, lichidul
amniotic.

Metoda imunogenetica - se utilizeaza in studiul

pacientilor si rudelor lor in cazurile de
imunodificienta ereditara. Permite determinarea
predispozitiei ereditare cu ajutorul markerilor
genetici (sistemul HLA).

Metoda gemenilor se bazeaza pe compararea

frecventei caracterelor la gemenii monozigoti
(identici) si dizigoti (neidentici).

In afara de examenele care se fac pentru toate

gravidele:
- hemoglobina (depistarea anemiei),
- grup sanguin, glicemie, teste pentru boli
infectioase (exemplu: RW - test pentru sifilis),
secretii vaginale,
- ecografie, sumar de urina, greutatea, tensiunea
arteriala, inaltimea fundului uterin precum si
prezenta batailor cordului fetal pentru femeile ce
intra in grupul de risc se mai fac teste
suplimentare, numai dupa acordul femeii, dupa o
consultatie medico-genetica.

Metode de diagnostic prenatal

Amniocenteza
Amniocenteza este un test efectuat asupra femeii
insarcinate, de obicei intre saptamanile 16 si 18.
Medicul introduce un ac subtire in abdomenul femeii
pentru a preleva o cantitate mica de lichid amniotic,
cca.20 de ml, ce inconjoara fetusul.
Analiza se face dupa o prealabila scanare
ecografica ce va releva imagini despre uter,
placenta, lichid amniotic si fetus. Celulele din lichidul
amniotic descuamate din tegumentele si mucoasele
fetusului sunt cultivate in conditii speciale si apoi
testate pentru prezenta anomaliilor cromozomiale.

Analiza serveste si la determinarea sexului copilului. Cand exista

posibilitatea unei cezariene sau riscul de nastere prematura,
amniocenteza poate ajuta si la stabilirea gradului de maturitate al
plamanilor copilului.
Ca si prelevarea de villus corionic, procedura are un risc scazut de a
provoca un avort spontan.

Amniocenteza este recomandata in urmatoarele

situatii:
Varsta materna inaintata. Cu cat inainteaza in varsta
femeile au un risc din ce in ce mai mare de a naste un
copil cu sindrom Down. In unele tari amniocenteza se
practica la toate gravidele peste 35 de ani. Optiunea
pentru a efectua testul prenatal poate sa apartina si
femeilor tinere
Familii in al caror istoric figureaza bolnavi cu
sindroame cromozomiale. In aceasta situatie nu
conteaza varsta mamei si este recomandata
amniocenteza pentru testarea cromozomilor
Familii in al caror istoric figureaza boli genetice, sau
daca parintii sunt purtatori ai unei boli genetice.
Depistarea ecografica a unor anomalii

Analiza vilozitatilor coriale:

Aceasta analiza permite diagnosticarea bolilor ereditare in

primul trimestru de sarcina (in saptamina 8-10 de sarcina).
Prioritatea acestei metode consta in faptul, ca daca se
determina
schimbari in dezvoltarea copilului, graviditatea
poate fi intrerupta prin recomandarea avortului terapeutic.
Prelevarea de villus corionic (Chorionic villus sampling
CVS) consta in recoltarea cu ajutorul unui cateter, care se
introduce in cervixul uterin, de tesut extraembrionar, care
din punct de vedere genetic este identic cu celulele fetale.

Removing a cell for

Searching for Chromosome and Gene Defects

diagnosis from a human
Pre-Implantation Genetic Diagnosis (PGD)

embryo.

The diagnosis: trisomy 21 (Down syndrome).

Testul alfa-fetoproteinei :
n perioada de nceput a vieii ftului, -fetoproteina
echivalentul fetal al albuminei de la adult, este principala
protein din snge, treptat ea fiind nlocuit de albumin.
Cu ajutorul acestei analize se determina cantitatea de alfafetoproteina, subsatnta elaborata de catre copil si ce trece in
singele mamei. Testul e cert in saptamana 20 de sarcina.
Cantitatea crescuta de aceasta substanta poate semnala o
malformatie deschisa de tub neural (anencefalia, spina bifida
- o maladie caracterizata prin dereglarea formarii coloanei
vertebrale si a maduvei spinarii).
In cazul in care se determina cresterea alfa-fetoproteinei,
deseori este necesar de efectuat si alte investigatii, cum ar fi:
ultrasonografia, amniocenteza.

Dozarea -fetoproteinei
n serul matern este
folosit pentru
screening-ul prenatal al
unor anomalii
congenitale, iar
aplicare testului triplu
permite depistarea
unor boli cromosomice,
pe baza probelor de
snge matern,
recoltate n a 16-a
sptmn de gestaie.

Anomalii congenitale care

determin creteri ale nivelelor
-fetoproteinei n lichidul
amniotic i serul matern
Defectele deschise ale tubului neural - spina bifida
Decesul spontan intrauterin
Omfalocelul i gastroschizisul
Atrezia esofagian sau intestinal
Sindromul nefrotic congenital
Hipoplazia dermic focal sau alte defecte
cutanate
Sindromul Meckel

Testul triplu const n dozarea n serul matern a fetoproteinei, estriolului neconjugat i a

gonadotropinei corionice umane (hCG fraciunea
). Atunci cnd primele dou au valori sczute, iar
hCG este crescut, triplul test este considerat pozitiv .
Triplul test pozitiv permite identificarea a cel puin
60% din sarcinile cu fei avnd sindrom Down.
Boala -fetoproteina Estradiolul
hCG

Sindromul Down

Trisomia 18

Sindromul Turner

PRICIPII SI TEHNICI
Dezvoltarea unor tehnici moleculare din ce n ce mai
sofisticate a condus la o explozie de informaii asupra
structurii i funciei genelor precum i asupra
mecanismelor de reglare a activitii lor.
Aplicarea acestor tehnici a culminat cu finalizarea n
anul 2001 a celui mai ndrazne i ambiios program
de investigare a biologiei umane, Proiectul Genom
Uman.
Impactul geneticii n practica medical, sntate
public i cercetarea medical, a devenit important i
unanim recunoscut. Volumul informaiilor referitoare
la aspectele moleculare ale patologiei umane se afl
ntr-un proces de cretere exponenial.

FISH

Principiul acestei metode de citogenetica moleculara este

hibridizarea prin complementariatea a unei sonde de AND
monocatenat de cca kb cu o anumita regiune a unui
cromozom.

Sonda este marcata fie direct prin incorporarea unui nucleotid

fluorescent fie indirect prin incorporarea unui nucleotid
modificat ce contine o molecula reporter (precum biotina sau
digoxigenina) care e recunoscuta de un ligand specific
(streptavidina pt biotina si Ac specifici pt digoxigenina)
conjugat cu un fluorocrom.

Sondele pot fi clasificate in tipuri in functie de aplicatia

practica: ---- - sonde specifice unui locus dat pt detectarea
deletiilor sau duplicatiilor submicroscopice; daca sonda nu se
fixeaza pe zona cromozomica careia ii corespunde(absenta
semnalului), atunci se poate concluziona deletia acestei zone
- sonde centromerice pt identificarea centromerului
- sonde telomerice
- sonde specifice unui cromozom care permit colorarea
particulara a unui/unor cromozomi/i.

Metafase normale

MetafaseconTRISOMIA

Izolarea ADN
Metoda

de izolare ADN se alege n

funcie de materialul din care este
izolat ADN: snge, ser, esut, oase,
mduv, lichid amniotic, etc.
n studiile de genetic molecular
sursa major o reprezint leucocitele
sangvine. Pornind de la civa mililitri
de snge, prelevat pe anticoagulant,
se pot obine cteva sute de
micrograme de ADN.

Protocol de lucru
Protocolul este ajustat pentru izolarea ADN din 2 ml snge.
Se preleveaz sngele (2ml) n tuburi Falcon sterile de 50-15 ml si s e adaug 7 ml
BLB 1x.
Tuburile se in pe ghea 30.
Centrifugare la 2500 rpm, 10.
Se elimin supernatantul si s e resuspend n 6 ml BLB.
Centrifugare la 2500 rpm, 10.
Se elimin supernatantul i se amestec cu 200 l BLB.
Centrifugare la 2500 rpm, 10.
Se elimin supernatantul i se resuspend n 100 l BLB.
Se adaug: 800 l WLB, 20 l Proteinaz K, 40 l SDS 20%. Se incubeaz peste
noapte la 370C.
Se adaug 240 l de NCl 6M si se agit puternic 15 secunde.
Centrifugare 15 la 3500 rpm, fr frn.
Se recupereaz supernatantul n 40 l NaCl si se agit 15 secunde.
Centrifugare 15 la 3500 rpm.
Se adaug 4 ml etanol 100% pentru precipitare (rcit la 40C).
ADN se recupereaz cu o pipet pasteur n 200 l etanol 70% (rcit la 40C), ntr-un
tub eppendorf de 1,5 ml.
Se centrifugheaz 10 la 2500 rpm.
Se las etanolul s evapore .
Se resuspend ADN n 200 l TE.
Se pune pe baie de ap la 650C, 30 pentru inactivarea nucleazelor.
Se las ADN s resuspende la temperatura camerei.
Se pstreaz la -20C.

Reacia de polimerizare n lan

(PCR)

Reacia de polimerizare n lan (PCR) este definit ca o

metod de sintez i amplificare enzimatic in vitro a unor
secvene de ADN
Reacia PCR este contituit din serii de trei pai eseniali,
care definesc un ciclu PCR:
denaturarea ADN matri dublu catenar
alinierea perechilor de primeri la matricele de ADN
monocatenar
extensia primerilor sub aciunea ADN polimerazei
ADN ce urmeaz a fi amplificat se afl n cantitate foarte
mic i este utilizat ca matri pe un sector limitat (ADN
int), delimitat de doi primeri, cu orientare opus, unul pe
catena matri 5'-3 iar cellalt pe catena matri 3'-5'.
Primerii sunt reprezentai de oligonucleotide sintetizate ,,in
vitro", reprezentnd piese scurte de ADN monocatenar, de
numai 20-50 nucleotide lungime.

Denaturarea (la
temperatura de
94oC)

Etapa de asociere a
primerilor
(la temperatura de
54-60oC)
Etapa de elongare
(la temperatura de
72oC)
2 copii (dup un
singur ciclu)

Aplicaii ale tehnicii PCR

Identificarea si analiza mutatiilor in ADN.

Detectarea mutatiilor punctiforme cunoscute si
necunoscute, prin digestie cu endonucleaze de
restrictie a produsului amplificat.
Detectarea polimorfismelor ADN pentru depistarea
indirecta a mutatiilor producatoare de boli.
Pe baza metodei PCR au fost elaborate programe
de screening al familiilor in care exista predispozitie
la diabet zaharat, boli coronariene, hipertensiune
arteriala, precum si unele forme de cancer.
Rol important
in diagnosticul prenatal si
presimptomatic al bolilor monogenice (boli cauzare
de o sigura mutatie genica)

Electroforeza

Este o metod care permite moleculelor ncrcate electric

s migreze n cmp electrostatic, spre polul de semn
contrar

Metod standard de analiz a acizilor nucleici

Mobilitatea electroforetic este determinat de urmatorii

factori: concentraia de agaroz, conformaia moleculei de
ADN, prezena bromurii de etidiu n gel, tamponul de
electroforez si voltajul aplicat.

Pentru electroforez se folosesc geluri de:

agaroz
poliacrilamid

Protocol de lucru
Pentru prepararea a 200 ml de gel de agaroz 2% n soluie tampon TBE 0,5x,
se cntresc 4 grame de agaroz ntr-un vas gradat i se completeaz pn
la volumul de 200 ml cu soluie tampon TBE. Se amestec bine.
Se nclzete soluia de agaroz pe o plit electric sau baie de ap
Dup formarea gelului, se las s rceasc pn la aproximativ 500C sau
pn se poate atinge vasul cu mna.
Se adaug bromura de etidiu, 10 l de soluie 10 mg/ml. Se amestec bine.

Se monteaz pieptenele

6. Se toarn gelul uor,

evitndu-se formarea de bule.

7. Dup ntrirea gelului acesta

se fixeaz n aparat, cu godeurile

poziionate la polul negativ.

8. La 10 l produs de PCR se
adaug 1 l de tampon de
ncrcare i se amestec.
9. Dac se observ plutirea
probelor nseamn c
tamponul de ncrcare nu are
densitatea necesar. Se poate
folosi acelai tampon dar ntro cantitate mai mare.
10.Electroforeza se realizeaz
la 100 V, 2-3 h, pn cnd
albastrul de bromfenol a
parcurs 2/3 din lungimea
gelului.
11.Dup migrarea probelor, se
ndeprteaz gelul din aparat,
i se pune acesta pe geamul
transiluminatorului pentru
vizualizare.

Cel mai utilizat sistem de

electroforez n gel de
agaroz este cel pe
orizontal.

Cel mai utilizat sistem

de electroforez n gel
de agaroz este cel pe
orizontal.

Metoda cea mai utilizat pentru vizualizarea ADN n

gelurile de agaroz i acrilamid este colorarea cu
colorantul fluorescent bromur de etidiu, care are
proprietatea de a se intercala ntre bazele stivuite din
ADN

Secvenierea ADN

Secvenierea ADN const n stabilirea cu exactitate a

succesiunii nucleotidelor dintr-o anumit regiune genomic.
n 1977 au fost publicate dou metode diferite prin care se
putea realiza secvenierea ADN: metoda degradrii chimice
Maxam-Gilbert i metoda enzimatic Sanger.

Principiu:
- se sintetizeaz o caten de ADN complementar fragmentului,
cu secven necunoscut, utiliznd ADN polimeraza i o amors
rediomarcat.
- reacia poate fi inhibat n dreptul unui anumit nucleotid, prin
folosirea unor analogi nucleotidici de tipul didezoxinucleotidelor
care au pierdut gruparea 3OH.
- ADN polimeraza poate aduga un astfel de nucleotid, dar dup
ce acesta a fost ncorporat, reacia se oprete datorit absenei
gruprii 3OH din didezoxinucleotid, necesar polimerizrii.
- se realizeaz fragmente cu o lungime egala distanei dintre
amors
i
locul
unde
s-a
ncorporat
un
anumit
didezoxinucleotid.

Molecula de ADN ce trebuie

secveniat este separat n cele
dou catene
Fiecare caten este clonat ntr-un
vector monocatenar, fiind inserat
ntr-un anumit situs, dup o
secven primer cunoscut i
marcat radioactiv sau fluorescent
Monocatenele de ADN servesc ca
matri pentru sinteza unei catene
noi, complementare, folosind ADN
polimeraza i nucleotidele necesare
sintezei.
Reacia se desfoara concomitent
n 4 eprubete; n fiecare se va
stabili localizarea unui anumit
nucleotid,
folosind
ca
analog
inhibitor
un
anumit
didezoxinucleotid.
Ansamblul celor patru reactii poate
fi citit pe o scara (pozitionala
directionata), de la fragmentele
mici la cele mari.