BAZA GENETICA SI

DIAGOSTICUL
MOLECULAR IN
HEMOGLOBINOPATII

Asist. Univ. Dr. Rodica TALMACI

2017
 HEMOGLOBINELE NORMALE
Molecula de hemoglobină este un tetramer format din 4 grupări hemice
(hem) şi globina constituită din 2 perechi de lanţuri polipeptidice.
Pe perioada dezvoltării, la om se sintetizează mai multe tipuri de Hb,
implicând 6 tipuri de lanţuri polipeptidice: α, β, δ, γ, ε, şi ζ.
Moleculele hemoglobinelor sunt constituite din asocierea a 2 lanţuri tip  cu:
2 lanţuri β în hemoglobina A (adultă majoră) 96-98%
2 lanţuri δ în hemoglobina A2 (adultă minoră) 1-3%
2 lanţuri γ în hemoglobina F (fetală) 0,5-1%
2 lanţuri ε în hemoglobina E (embrionară)

Molecula tetramerica de Hb

•Hemoglobina embrionară (HbE):

Gower I - ξ2ε2
Portland - ζ2γ2
Gower II - 22
•Hemoglogina fetală (HbF) - 2γ2
•Hemoglobina adultă (HbA) - 22
•Hemoglobina 2 adultă (HbA2) - 22

Tipurile de lanţuri globinice sintetizate la

diferite etape de dezvoltare
 HEMOGLOBINA ADULTA

Inainte de naştere, când sinteza catenelor

 încetează, iar locul de sinteză a Hb se
deplasează în măduva osoasă, sunt
sintetizate catenele  şi  (Hb A)
împreună cu câteva polipeptide  de tip 
(Hb A2).

Locul de sinteză a lanţurilor globinice pe durata dezvoltării

— HbA2 (22)
 SECVENTELE REGLATOARE ALE
GENELOR GLOBINICE
Pentru ambele clustere - şi -globinice, genele sunt aranjate în cromozomi în ordinea în care ele sunt
exprimate pe durata dezvoltării ontogenetice. În plus, există o diferenţă importantă între genele -globinice
care suferă o singură comutare în dezvolate (embrionarăfetală/adultă), şi genele -globinice care suferă o
comutare adiţională aproape de momentul naşterii (embrionarăfetalăadultă).
Clusterul genic -
globinc se află sub Elementul reglator -
controlul regiunii de globinic HS-40 pare să
control al locusului  îndeplinească funcţii
(-LCR), un element similare în clusterul -
reglator major, globinic ca şi -LCR în
localizat la clusterul -globinic.
aproximativ 5-20 kb
în faţa genei .
Organizarea structurală a clusterilor genici - şi -globinici şi secvenţele lor reglatoare

-LCR poate interacţiona cu oricare dintre gene în orice stadiu de

dezvoltare, dar interacţionează preferenţial cu gena -globinei în sacul
vitelin. Conform modelului, în ficatul fetal, -LCR va interacţiona
preferenţial cu genele -globinei care, în stadiul adult, sunt supresate pe
rând. S-au stabilit cel puţin două situsuri de legare candidate pentru factori
de supresie. Acest model nu explică însă cum genele - şi -globice sunt
silenţiate în stadiile timpurii ale dezvoltării eritroide. Unele dovezi rezultate
din studii asupra mutaţiilor naturale şi din experimente pe şoareci
transgenici cu combinaţii de gene sugerează că, în acest proces, un rol
important îl joacă competiţia genelor pentru -LCR şi, în special, gena -
globinei.
SINDROAMELE TALASEMICE

CANTITATIVE

HEMOGLOBINOPATII

CALITATIVE

HEMOGLOBINE “ANORMALE”
VARIANTE DE HEMOGLOBINE ANORMALE
Sediul hemoglobinei se afla in eritrocite. Daca hemoglobina este scazuta
eritrocitele sunt mai mici si mai goale. Este ceea ce se numeste anemie hipocroma
si microcitara.
Ex: Hb S, C, D, O, Quebec, etc
 SINDROAMELE TALASEMICE
Talasemiile reprezinta un grup de boli genetice, caracterizate prin scaderea
cantitatii de hemoglobina.
 http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html

BAZA GENETICA MOLECULARA A

TALASEMIEI
Molecula integrala de hemoglobina este un tetramer 22.

Reprezentarea schematică a genelor globinice

Mutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -
globinei, se cunosc peste 1200 de mutaţii ce determina transformarea in gene talasemice.
 CLASIFICAREA GENETICA A
TALASEMIILOR
IN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:
1. .α-TALASEMIE
2. .β-TALASEMIE
3. .δβ-TALASEMIE
4. .γδβ-TALASEMIE
 CE ESTE β-TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE β-GLOBINICE PRODUC β-TALASEMIA

Cromozomii
11
MUTATII CE DETERMINA
- TALASEMIA








CONTROLUL GENEI β-GLOBINEI
MUTATII IN PROMOTORUL GENEI β-GLOBINA

CCACACCC ATAAAA
-108
CCTCACCC
-93 -76
CCAAT
-31
β-globina
T T G G G C
G
EROARE DE SPLICING IN GENA β–GLOBINEI:
IVS I -110 – situs acceptor nou

ADN

ARNm

IVS1 +110 G>A

ADN

ARNm
MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE)
IN -TALASEMIE
FORMELE HETEROZIGOTE
DE β–TALASEMIE:
•Talasemia minima/silentioasa
– β++/ N
•Talasemia minora – +/N sau
0/N

FORMELE HOMOZIGOTE DE
β–TALASEMIE:
•Talasemia intermediara –
+/+ sau 0/+
Cariotip normal, 46, XY
•Talasemia majoră – 0/0
 Heterozigot

Heterozigot compus =
Dublu heterozigot

Homozigot
Daca ambii parinti sunt purtatori
de gena β-globinica defecta exista
riscul de 25% ca la fiecare sarcina
sa se nasca un copil cu β-
talasemie majora sau anemie
Cooley.
 Fenotip
β-talasemie
majora
 CE ESTE α-TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE α-GLOBINICE PRODUC
α-TALASEMIA

Cromozomii
16

Daca o persoana are o singura gena α-globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestare
clinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de α-talasemie. Diagnosticul este pus numai prin teste
genetice si este mai curand un diagnostic “deductiv” la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu α-talasemie.
Daca persoana are doua gene α-globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de α-talasemie minora. De regula, nu exista
manifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul este
gresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului,
deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom
(pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are α-talasemie minora cu genele defecte
in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este
defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene α-talasemice defecte, adica boala Hb
H. Daca ambii parinti au α-talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca
la fiecare sarcina sa apara α-talasemia majora, in care toate genele α-globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart -
Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.
DELETII α-TALASEMICE
Daca ambii parinti au α-talasemie
minora cu genele defecte in
pozitie trans (pe cromozomi
diferiti) copiii lor vor mosteni α-
talasemie minora.
Daca un parinte are α-talasemie
minora cu genele defecte in pozitie
cis (situate pe acelasi cromozom),
iar celalat parinte are conditia de
purtator silentios (o singura gena
este defecta), exista riscul de 25%
ca la fiecare sarcina sa se nasca
un copil cu trei gene α-talasemice
defecte, adica boala Hb H.
Daca ambii parinti au α-talasemie
minora cu genele defecte in pozitie cis
(pe acelasi cromozom) exista riscul de
25% ca la fiecare sarcina sa apara α-
talasemia majora, in care toate genele
α-globinice sunt defecte, adica
Hemoglobina Bart - Hidrops Fetalis
si produsul de conceptie nu este viabil
si va muri in uter.
 VARIANTE TALASEMICE
-TALASEMIA
Conditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeaza
printr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut.
Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pe
cromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta gena
poate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge:
•  Macedonia
•  Sicilia
•  Lepore
-talasemia homozigota este similara
cu -talasemia, dar simptomele sunt mai
usoare. Majoritatea pacientilor supravietuiesc
pana la viata adulta cu necesitati minime de
transfuzie.
-talasemia heterozigota este similara cu
-talasemia minora, dar simptomele tind sa
fie mai putin severe.

Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei contine
secventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului -
globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington,
Hollandia, Baltimore.
In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice si
hemograma sunt identice cu cele de -talasemie majora
In Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora
DIAGNOSTICUL MOLECULAR
IN HEMOGLOBINOPATII
PRINCIPALII INDICI HEMATOLOGICI IN β-
TALASEMIA HETEROZIGOTA
 TESTELE DE GENETICA MOLECULARA
IN TALASEMIE
STRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la “cautarea” modificarilor
produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice.
α-talasemiile si -talasemiile sunt consecinta unor deletii ale genelor globinice, in timp ce β-talasemiile
sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul acestor gene β-globinice.
In scopul identificarii mutatiilor -talasemice se procedeaza la urmatoarea etape:

Recoltarea de sange periferic – extractie ADN din sange – amplificare prin PCR a genelor de investigat

Prin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes.
Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare
intr-un diagnostic molecular.
SINDROAMELE TALASEMICE

•α-talasemie α-globina

•β-talasemie β-globina

•-talasemie -globina

•-talasemie -,-globina

•γ-talasemie γ-,-,-globina
 SCHEMA DE REALIZARE A
DIAGNOSTICULUI MOLECULAR

celula EXTRACTIE
ADN genomic
nucleata
ADN

gena de interes

PCR
cu primeri specifici

DETECTIE
prin motoda electroforetica

>106 copii
 EXTRACTIE ADN
ETAPE:
1. Liza celulara
2. Liza nucleara
3. Deproteinizare
4. Precipitare ADN
5. Purificare ADN
6. Obtinere ADN genomic concentrat, foarte pur
 PRINCIPIUL PCR
(Polymerase Chain Reaction)

Replicarea ADN
semiconservativa

Principul PCR: Sinteza unei regiuni ADN prin

refacerea structurii dublu catenare pe baza
complementaritatii nucleotidelor:
A (adenina) – T (timina)
G (guanina) – C (citozina)
 http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT –

PCR
ADN genomic

gena de interes

3 ETAPE:
 http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT –

PCR
ADN genomic

gena de interes

3 ETAPE:

1. Denaturare – 90-95oC – 1 min

 http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT –

PCR
ADN genomic

gena de interes

3 ETAPE:

1. Denaturare – 90-95oC – 1 min

20-30 cicluri

2. Alinierea primerilor – 55-65oC - 0,5 min

3. Polimerizare – 72oC – 2 min

 Amestec de reactie PCR:

 ADN (template)
 Amestec tampon PCR:
Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2
 Primer F (forward)
 Primer R (reverse)
 Nucleotide (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP)
 ADN polimeraza (Taq DNA
polynerase)
 PCR
Polymerase Chain Reaction
AMPLIFICAREA EXPONENTIALA
DETECTIE PRIN ELECTROFOREZA IN
GEL DE AGAROZA
 STRUCTURA GENELOR GLOBINICE

Toate genele globinice au o structură similară.

Secvenţele codificatoare se află în 3 exoni,
separaţi de 2 introni .
Fiecare genă deasemenea, are secvenţe
promotoare 5', regiuni netranslate 5'
(5' UTR) şi 3' (3' UTR).

Structura genei -globinei - secvenţa nucleotidică

 METODE DE IDENTIFICARE A
MUTATIILOR -TALASEMICE
ANALIZA SITUSULUI DE
ELECTROFOREZA IN GEL RESTRICTIE IN FRAGMENTE
CU GRADIENT DE DE AMPLIFICARE PCR
DENATURARE (DGGE) (PCR-RFLP)
AMPLIFICARE SPECIFICA
A ALELELOR MUTANTE
(ARMS-PCR) Amplificarea fragmentelor
Amplificare seriata a
fragmentelor -globinice: genice -globinice urmata
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV de restrictie enzimatica

Electroforeza Electroforeza in gel de Electroforeza in gel de

fragmentelor F, I, II, III, IV agaroza agaroza
in gel de poliacrilamida
METODE DE IDENTIFICARE A MUTAŢIILOR
-TALASEMICE
ANALIZA SITUSULUI DE
ELECTROFOREZA îN GEL RESTRICŢIE ÎN FRAGMENTE
CU GRADIENT DE DE AMPLIFICARE PCR
DENATURARE (DGGE) (PCR-RFLP)
AMPLIFICARE SPECIFICĂ
A ALELELOR MUTANTE
Amplificare seriată a Amplificarea fragmentelor
(ARMS-PCR) genice -globinice urmată
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV de restricţie enzimatică

Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV Electroforeza în gel de Electroforeza în gel de
în gel de poliacrilamidă cu agaroză agaroză
gradient de denaturare
 ELECTROFOREZA ÎN GEL CU
GRADIENT DENATURANT (DGGE)
Scanarea intregii gene -globinice pentru identificarea mutatiilor

Intr-o prima etapa se amplifica seriat 5 fragmente

ce compun intreaga gena -globinica

In urmatoarea etapa se realizeaza electroforeza

fragmentelor amplificate in DGGE.

In functie de modelul electroforetic obtinut avem informatia

despre prezenta sau absenta unei mutatii in fragmentul
analizat si locul genic al mutatiei.
Daca utilizam probe control, prin compararea modelelor
electroforetice, obtinem informatia privind mutatia exacta.
 DGGE
Gena -globinei a fost împărţită în 5
fragmente diferite (Fr. F, Fr. I, Fr. II,
Fr. III, Fr. IV), ce acoperă întreaga
regiunea de codificare şi secveţele
de flancare 5' şi 3'.

350 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru

electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’

Cele mai frecvente mutaţii identificate în fragmentul F:

Mutatia –87 (C-G) - ++
Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaţia IVS II-745 (C-G) - +
Polimorfismul cd2 (C-T)

Fr. F

Fr. F

cd 2/N -87/N N/N +20/N N/N +20/N +20/+20 cd2/N -101/N N/N N/N -87/N N/N

cd 2/N -87/N N/N cd2/N +20/N N/N N/N -101/N N/N cd2/N cd2/N cd2/N cd2/cd2 N/N
 DGGE
250 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru

electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’.

Cele mai frecvente mutaţii identificate in fragmentul I:

cd 6 (-A) - 0
Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaţia IVS II-745 (C-G) - +
Polimorfismul cd 2 (C-T)
Fr.I

Fr. I

N/N +20/+20 cd 6/N N/N +20/N N/N + 20/N N/N cd 2/N N/N cd 5/N

+20/+20 +20/N cd 2/N cd2/N N/N cd2/N cd6/N

 DGGE

370 pb
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’
Cele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II:
IVS I-1 (G-A) - 0
IVS I-6 (T-C) - +
IVS I-110 (G-A) - +
cd 39 (C-T) - +

Fr. II

Fr. II

Fr. II
Cd 39/N N/N cd 39/N N/N IVS I-1/N IVS I-1/N

IVS I-110/N N/N IVS I-110/ cd39/N IVS I-110/N IVS I-6/N cd 39/N
IVS I-110
IVS I-110/N N/N N/N cd 39/N N/N IVS I-110/N
 DGGE
420 pb

300 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru

electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’.

Cele mai frecvente mutatii produse in fragmnetul IV:

•mutaţia în semnalul de poliadenilare (AATAAA-AATGAA) - +
•mutatia +1480 (C-G) - +
Fr. IV

Poli A cd+6/N poli A

(+1480)
 METODE DE ANALIZĂ A MUTAŢIILOR
-TALASEMICE
ANALIZA SITUSULUI DE
ELECTROFOREZA ÎN GEL RESTRICŢIE ÎN FRAGMENTE
CU GRADIENT DE DE AMPLIFICARE PCR
DENATURARE (DGGE) (PCR-RFLP)
AMPLIFICAREA SELECTIVĂ
A ALELELOR MUTANTE
Amplificare seriată a Amplificarea fragmentelor
(ARMS-PCR) genice -globinice urmată
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV de restricţie enzimatică

Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV Electroforeza în gel de Electroforeza în gel de
în gel de poliacrilamidă cu agaroză agaroză
gradient de denaturare
 AMPLIFICAREA SELECTIVĂ A
ALELELOR SPECIFICE
Metoda se aplica pentru identificarea mutaţiilor punctiforme cunoscute. In amplificarea PCR se
utilizeaza un primer care prezinta aceeasi secventa de nucleotide cu ADN matrita, cu exceptia
nucleotidului terminal 3‘. Acesta este complementar cu nucleotidul modificat prin mutatie.
Taq-polimeraza necesita o complementaritate perfecta a primerului la capatul 3' pentru a putea realiza
polimerizarea.
Astfel, alela dorita este intens amplificata. In cazul neamplificarii rezultatul este nepotrivirea dintre
ADN matrita si oligonucleotidul primer.
Pentru a confirma aceasta conditie, in amestecul de reactie se introduc 2 primeri control care
amplifica un fragment de alta dimensiune.

Mutatia IVS I-110 (G-A)

Banda control de
861 pb

Banda specifică
mutaţiei IVS I-
110 de 390 pb
 METODE DE ANALIZĂ A MUTAŢIILOR
-TALASEMICE
ANALIZA SITUSULUI DE
ELECTROFOREZA ÎN GEL RESTRICŢIE ÎN FRAGMENTE
CU GRADIENT DE DE AMPLIFICARE PCR
DENATURARE (DGGE) (PCR-RFLP)
AMPLIFICAREA SELECTIVĂ
A ALELELOR MUTANTE
Amplificare seriată a Amplificarea fragmentelor
(ARMS-PCR) genice -globinice urmată
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV de restricţie enzimatică

Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV Electroforeza în gel de Electroforeza în gel de
în gel de poliacrilamidă cu agaroză agaroză
gradient de denaturare
 ENZIME DE
RESTICTIE

EcoRI (Escherichia coli)

 ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICŢIE
PRIN METODA PCR - RFLP
Unele mutaţii punctiforme pot
crea sau desfiinţa un situs de
restricţie în secvenţa ADN.
Aceste mutatii pot fi
identificate prin analiza
situsului de restricţie.

Prin stabilirea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie ne dam

seama daca s-a produs mutatia cautata.
 SECVENTIEREA ADN
Metoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unui
fragment ADN de interes
REAL TIME PCR
 REAL TIME PCR GENOTYPING

Detectie prin metoda

Melting Curve Analysis

IVS I-110 mutation

 IDENTIFICAREA DELEŢIILOR - Si -
TALASEMICE GENICE GLOBINICE PRIN
METODA GAP-PCR
Metoda GAP-PCR se aplica in
identificarea deletiilor genice mari.
Metoda se bazeaza pe tehnica de
amplificare PCR cu 3 primeri specifici
pentru fiecare deletie. Acestia sunt
utilizati in aceeasi reactie de
amplificare, conducand la amplificarea
unui singur produs specific deletiei si
o banda control, de marime diferita,
corespunzatoare alelei normale.

deleţia  Macedonia (11,5 kb)

-talasemia

MED-I/ MED-I/ 20,5/ MED-I/ 20,5/

    

0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7

kb) = Boala Hb H
-talasemia
 STUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIA
SPECTRUL MUTATIILOR -TALASEMICE IDENTIFICATE
IN ROMANIA

-talasemia
α MED/N
α 3.7/N
0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H
ααα/N

-talasemia
deleţia  Macedonia (11,5 kb)
deleţia  Lepore
O NOUA MUTATIE IN SITUSUL CAP
AL GENEI β-GLOBINEI - MUTATIA
CAP+3 (A-T)
 TESTAREA PRENATALA PENTRU
TALASEMIE
Pentru cuplurile la care diagnosticul de
talasemie minora a fost pus la ambii parinti,
dupa ce partenera a ramas insarcinata, se
recomanda efectuarea testelor de genetica
moleculara la fat pentru a identifica prezenta
mutatiilor talasemice.
Probele de material fetal se obtin prin
AMNIOCENTEZA sau prelevare de probe
din VILOZITATILE CORIALE. Ambele pot fi
efectuate numai in centre specializate sub
control ecografic.
Amniocenteza se efectueaza dupa
saptamana a 15-a de sarcina prin recoltarea
de 10-15 ml de lichid amniotic.
Biopsia din vilozitatile coriale se poate
efectua in saptamana 10-12 de sarcina prin
recoltare de fragmente foarte mici de tesut
cu origine fetala.

ADNul extras din lichid amniotic sau vilozitati coriale

este analizat prin metodele moleculare pentru
identificare şi caracterizare de mutaţii -talasemice
prezente în genotip.
Prin aceste metode se stabileste diagnosticul de
homozigot (bolnav) sau heterozigot (purtator) al -
talasemiei, se identifica mutatia exacta prezenta la fat
si se anticipeaza fenotipul sau.

ANALIZA ADN
 PRIMUL CAZ
“SCANAREA” GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
250 pb

370 pb
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza in gel cu gradient denaturant.
electroforeza in gel cu gradient denaturant.

Allela IVS I-110

Allela IVS II-745
Alela Normala
Alela Normala

Pattern-uri DGGE in fragmentul I. Pattern-uri DGGE in fragmentul II.

1-ADN mama (N), 2-ADN tata (pozitiv), 3- 1-ADN bunica (N),
ADN bunic (pozitiv), 4-ADN fetal pozitiv 2, 3-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS I-110 (G-A),
pentru mutatia IVS II-745 (C-G), 5-ADN 4-ADN mama (pozitiv),
bunica (N). 5-ADN control negativ.
REZULTATE

GENOTIP FENOTIP
FETUS Homozigot IVS I-110 .β+/ β+
(G-A) / IVS II-745 (C-G)
MAMA heterozigot IVS I-110 (G- .β+/ βA
A) / N
TATAL heterozigot IVS II-745 .β+/ βA
(C-G) / N
BUNICUL PATERN heterozigot IVS II-745 .β+/ βA
(C-G) / N
BUNICA PATERNA Normal .βA/ βA
 AL DOILEA CAZ
“SCANAREA” GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII

250 pb Pattern-uri DGGE in fragmentul I.

1-ADN control negativ,
2-ADN fetal din proba de lichid amniotic (pozitiv-
contaminare),
3-ADN control pozitiv pentru polimorfism cd 2 in
stare heterozigota,
Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza in gel cu gradient denaturant.
4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA +
polimorfism cd 2 in trans),
5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd
8 (-AA) in stare homozigota,
6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare
heterozigota,
7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in
stare heterozigota,
8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in
stare homozigota.
Alela normala

Alela -talasemica
cd 8 (-AA)
REZULTATE

GENOTIP FENOTIP

FETUS Homozigot cd 8 (-AA) / .β0/ β0

cd 8 (-AA)

MAMA heterozigot cd 8 (-AA)/ N .β0/ βA

TATA heterozigot cd 8 (-AA)/ N .β0/ βA

 RESULTS

GENOTYPE PHENOTYPE
FETUS Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) .β+/ β+

MOTHER heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β+/ βA

FATHER heterozygot IVS II-745 (C-G) / N .β+/ βA

FETUS Homozygot CD 8 (-AA) / CD 8 (-AA) .β0/β0

MOTHER heterozygot CD 8 (-AA)/N .β0/βA

FATHER heterozygot CD 8 (-AA)/N .β0/βA

FETUS Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) .β+/ β0

MOTHER Heterozygot IVS II-745 (C-G) / N .β+/ βA

FATHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β0/ βA