Rezumat Diaconu (Harapu) Camelia

Studiul unor interaciuni aliment - medicament
UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

GR. T. POPA IAI
FACULTATEA DE FARMACIE
STUDIUL UNOR INTERACIUNI

ALIMENT - MEDICAMENT
Rezumatul tezei de doctorat
CONDUCTOR TIINIFIC,
PROF. DR. RODICA CUCIUREANU
DOCTORAND,
FARMACIST CAMELIA DIACONU HARAPU
IAI, 2011
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai

Facultatea de Farmacie
Doamnei / Domnului...............................................................
V facem cunoscut faptul c n ziua de 14 iulie 2011 la ora
11.00 n sala S.M.N. din cadrul universitii de Medicin i Farmacie
Gr. T. Popa Iai, va avea loc susinerea public a tezei de doctorat
intitulat Studiul unor interaciuni aliment - medicament
elaborat de d-na farmacist Camelia Diaconu Harapu, conductor
tiinific prof. Dr. Rodica Cuciureanu, n vederea conferirii titlului
tiinific de doctor n Domeniul fundamental tiine Medicale,
domeniul Farmacie. V invitm s participai la aceast manifestare.
Comisia de doctorat are urmtoarea componen:
PREEDINTE: Decan Prof.Univ.Dr. Monica Hncianu
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa
Iai, Facultatea de Farmacie
CONDUCTOR
TIINIFIC: Prof.Univ.Dr. Rodica Cuciureanu
REFERENTI OFICIALI:
Prof.Univ. Dr. Anca Miron
Conf. Univ. Dr. Lorena Filip
Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu
Haieganu Cluj Napoca, Facultatea de Farmacie
Conf. Univ. Dr. Ana Corina Ioni
Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila
Bucureti, Facultatea de Farmacie
CUPRINS
Capitolul I
I.1. Introducere
I.2. Motivaia alegerii temei
I.3. Obiectivele tezei de doctorat
PARTEA GENERAL. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII
Capitolul II
II.1. Interaciuni aliment medicament. Aspecte generale
II.2. Interaciuni aliment-medicament. Domenii de interes
II.3. Influena medicaiei asupra status-ului nutritiv al
organismului
II.4. Interactiuni suc de grapefruit medicamente
II.4.1. Istoric
II.4.2. Suc de grapefruit: compozitie chimic
II.4.2.1. Arborele de grapefruit
II.4.2.2. Componente bioactive din sucul de
grapefruit
II. 4.3. Metabolizarea medicamentelor, interaciuni
medicamentoase,
interaciuni
aliment
medicament
II.4.3.1. Citocrom P450 (CYP), enzime,
interaciuni
medicamentoase
i
interaciuni aliment - medicament
II.4.3.2. Transportori de medicamente sau/i de
xenobiotice
II.4.4. Mecanisme de inhibiie a enzimelor citocromului
P450
II.4.5. Efectele sucului de grapefruit asupra
metabolismului medicamentelor
II.4.5.1. Ingrediente active din sucul de
grapefruit
flavonoide
i
furanocumarine
II.5. Antinflamatoare nesteroidiene (Diclofenac). Aspecte
generale
PARTEA PERSONAL
Capitolul III
Studiul interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de
grapefruit
III.1. Introducere. Aspecte generale privind farmacocinetica
diclofenacului
i
Pg.
1
1
5
8
9
9
9
12
16
17
17
21
21
24
28
28
32
36
41
42
47
50
50
50
50

III.2. Validarea metodei HPLC de determinare a diclofenacului
III.2.1. Protocol de validare
III.2.1.1. Sinopsis
III.2.1.2. Materiale i metoda analitic
prezentare
III.2.2. Determinarea concentratiei de diclofenac
III.2.3. Procedura de validare
III.2.3.1. Specificitatea
III.2.3.2. Curba de calibrare (Liniaritate)
III.2.3.3. Precizia si acuratetea
III.2.3.4. Limita de cuantificare inferioar
III.2.3.5. Validarea dilutiei probelor
III.2.3.6. Regasirea
III.2.3.7. Probele de control
III.2.4. Raport de validare
III.2.4.1. Sinopsis
III.2.4.2. Specificitatea
III.2.4.3. Liniaritatea
III.2.4.4. Limita inferioar de cuantificare
III.2.4.5. Precizia i acurateea
III.2.4.6. Regsirea
III.2.4.7. Validarea diluiei
III.3. Studiul interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i
sucul de grapefruit
III.3.1. Stabilirea modelului experimental
III.3.2. Aplicarea modelului experimental. Etapa clinic
III.3.3. Etapa analitic. Rezultate
III.3.4. Etapa farmacocinetic
III.3.5. Discuii. Mecanismul interaciunii
III.3.6. Concluzii
Capitolul IV
Flavonoidele componente bioactive din sucuri de fructe
IV.1. Introducere
IV.2. Rspndire
IV.3. Structur
IV.4. Clasificare
IV.4.1. Calcone
IV.4.2. Flavanone
IV.4.3. Flavanonoli
IV.4.4. Flavone
IV.4.5. Flavonoli
IV.4.6. Catehine
IV.4.7. Terpenil-flavonoide
ii
54
54
55
55
59
59
59
60
60
60
60
61
61
61
61
61
62
64
64
64
64
65
65
65
66
67
75
83
85
85
85
85
86
87
87
87
88
88
89
90
90

IV.4.8. Izoflavonoide
IV.4.9. Aurone
IV.4.10. Antociani
IV.5. Naringina flavonoid din fructele citrice
IV.5.1. Aspecte generale
IV.5.2. Mecanism de ac iune
IV.6. Determinarea flavonoidelor totale din sucuri de fructe
IV.7. Determinarea HPLC a naringinei i naringeninei din sucuri
de fructe
IV.7.1. Metoda de analiz
IV.7.1.1. Standarde
IV.7.1.2.Condiiile de lucru HPLC
IV.7.1.3.Condiiile de lucru MS
IV.7.2. Analiza naringeninei
IV.7.3. Analiza HPLC a naringinei
IV.7.3.1. Determinarea naringinei din probe de
sucuri
IV.7.3.1.1. Rezultate
IV.7.3.1.2. Discuii
IV. 8. Concluzii
Capitolul V
Furanocumarinele - substane bioactive din sucul de grapefruit
V.1. Introducere
V.2. Furanocumarinele implicaii n producerea interaciunilor
suc de grapefruit-medicamente
V.2.1. Cumarine i derivai
V.2.2. Structura chimic i clasificare
V.2.3. Furanocumarinele componente bioactive din
sucul de grapefruit
V.2.3.1. Biosinteza bergamotinei
V.2.3.2. Rolul furanocumarinelor din sucul de
grapefruit
n
producerea
interaciunilor farmacocinetice cu
unele medicamente
V.3. Determinarea bergamotinei din sucuri de fructe
V.3.1. Material i metode
V.3.1.1. Extracia bergamotinei
V.3.1.2.
Separarea
bergamotinei
prin
cromatografie pe coloan (CC)
V.3.1.3. Identificarea bergamotinei prin
cromatografie pe strat sub ire (CSS)
V.3.1.4. Analiza HPLC a bergamotinei
V.3.1.5.Curba de calibrare a bergamotinei
iii
91
92
93
94
94
95
98
104
104
104
105
105
106
111
126
144
147
148
150
150
150
151
151
152
158
160
162
163
163
164
165
165
165
166

V.3.2. Rezultate i discuii
V.4. Concluzii
Capitolul VI
Studiul comparativ al influenei unor sucuri de fructe asupra
farmacocineticii diclofenacului, la obolan
VI. 1. Introducere
VI. 2. Obiective
VI. 3. Protocol experimental
VI. 4. Etapa analitic. Rezultate
VI. 5. Discutii
VI. 6. Concluzii
Capitolul VII
Concluzii generale
Elemente de originalitate
Perspective de cercetare
Bibliografie
iv
175
195
196
196
196
197
197
198
203
208
209
209
211
211
212
Capitolul I
I. 1. INTRODUCERE
Medicamentele administrate pe cale oral au acelai parcurs n sistemul
digestiv ca i alimentele/sucurile naturale. n producerea interaciunilor
medicament - aliment, intervin proprietaile fizico-chimice ale moleculelor de
medicament, calitatea i compoziia alimentaiei, ordinea n care sunt ingerate
medicamentele i alimentele, intervalele de timp ntre acestea, s.a.m.d. astfel c,
se impune din ce n ce mai imperios, pe perioada administrrii unui medicament,
un control strict al dietei n vederea eficientizrii terapeutice a tratamentului dar
i pentru a asigura nevoile energetice i nutritive ale alimentaiei.
Medicii adepi ai terapiilor complementare, susin faptul c sucurile
proaspete s-au dovedit a fi o arm impotriva bolilor, studiile artnd c sucurile
naturale pot s grabeasc procesul de vindecare al unor boli cnd sunt folosite
impreun cu alte metode naturale precum homeopatia, plantele medicinale,
terapiile nutriionale, prin mrirea capacitaii naturale de vindecare a
organismului i ntrirea sistemului imunitar.
Medicii alopai, adepi ai terapiei medicamentoase, nu exclud terapia cu
sucuri naturale, asociat celei medicamentoase, numai c inaintea nceperii unei
astfel de cure, este recomandat un consult medical, pentru c nu toi pacienii pot
beneficia de astfel de asocieri. De exemplu, o afeciune nedepistat (diabet sau
hipoglicemie) poate, far un tratament medical adecvat, s se nrautaeasc din
cauza curei cu sucuri naturale; mai mult de att, tot ce ingeram poate s
interacioneze cu altceva, astfel c natural, nu inseamn i sigur, santos i
benefic pentru organism n toate cazurile.
Referitor la sucurile naturale, corect preparate i administrate, singura
problem, spun nutriionitii, este legat de faptul c acestea nu pot s furnizeze
cele 20 25g de fibre zilnic de care au nevoie adulii; totodat, acetia ne
recomand, pentru beneficiu maxim, sucurile preparate n gospodrie i
consumate imediat dupa preparare i nu cele din supermarketuri (chiar dac sunt
declarate 100% naturale), care nu seamn nici nutriional i nici estetic cu cele
preparate n momentul utilizrii, pentru c pasteurizarea (practicata pentru a mri
durata de valabilitate) distruge vitaminele i enzimele din sucuri. Si tot pentru
beneficiu maxim, este recomandat s folosim fructe i legume proaspete,
crescute n tar (mai proaspete dect cele importate), fr pesticide (la care nu se
tiu nca toate efectele pe termen lung) i aditivi de cretere i maturizare.
Preocuparea cercettorilor privind studiul "comorilor" din regnul vegetal
este o adevrat megatendina a cercetrii noului mileniu; de cnd industria
farmaceutic a nteles deschiderea consumatorilor ctre aceast categorie de
produse alimentare, unele cu utilizri fitoterapeutice, cercetarea fitochimic a
devenit chiar o mod.
1
In topul celor mai sntoase fructe, grapefruitul este campion, un

adevrat soare n constelaia remediilor naturale, o vedet a stilului de viat
sntos, atribuindu-i-se proprietai curative remarcabile, fapt pentru care se
bucura de atenia binemeritat a cercettorilor (Mencinicopschi, 2009).
Consumul pe scara larg al grepfruitului nu poate fi atribuit numai
gustului sau valorii sale nutritive. De fapt, entuziasmul consumului su, se
datoreaz macar n parte cercetrilor medicale care au sugerat c sucul de
grepfruit reduce formarea plcilor aterosclerotice i inhib proliferarea celulelor
canceroase la nivel mamar, ca i tumorigeneza mamar; ulterior, s-a demonstrat
c sucul de grepfruit conine antioxidani, substane cu aciune antinitrozaminica,
antiseptic, detoxifiant, cardiotonic, sedativ i hipocolesterolemiant. n
lumina acestor aciuni, grepfruitul a fost indicat mult timp pentru tratamentul
anorexiei, diferitelor infecii, hipertrofiei benigne de prostat, cancerelor (de sn,
colon, prostat, piele, plmn), diabetului, disuriei, hipercolesterolemiei,
insomniei, micozelor etc.
Date din literatura de specialitate semnaleaz o scadere semnificativ a
nivelului colesterolului la persoanele care consum un grapefruit/zi, fapt pentru
care grapefruit-ul a intrat pe lista mondial a alimentelor care reduc incidena
bolilor de inima. n 1991 s-au semnalat primele informaii privind interaciunea
medicamentoas ntre sucul de grapefruit i unele medicamente blocante ale
canalelor de calciu: felodipina (Plendil) i nifedipina (Adalat). Acest fenomen a
fost descoperit din ntmplare, n urma unui studiu al interaciunii etanolmedicament n care sucul de grapefruit a fost utilizat ca vehicul pentru alcoolul
folosit n studiu (cu scopul de a masca gustul alcoolului). Observaia a fost
surprinztoare i pentru cercettorii n cauz (coordonator studiu dr. David
Bailey, cercettor n cadrul Health Sciences Center de la Londra) aa c, au
ntmpinat greuti atunci cnd au dorit s publice studiul ntr-o revist de
medicin, observaiile i concluziile fiind considerate o glum.
Ulterior, au fost realizate studii experimentale pe animale de laborator i
numeroase studii clinice care demonstreaz existena interaciunilor sucului de
grapefruit cu medicamente din diferite clase terapeutice: antagoniti ai canalului
de Ca, modulatori ai SNC (Hukkinen et al., 1995; Kupferschmidt et al., 1995;
Ozdemir et al., 1998) inhibitori HMG-CoA reductaza, imunosupresoare,
inhibitori ai 5-fosfodiesterazei, antihistaminice, prokinetice, antiaritmice etc.
(Dahan et al., 2004).
I.2. MOTIVAIA ALEGERII TEMEI
Interaciunile medicamentoase reprezint o surs major de accidente
sau de eecuri terapeutice, mai ales n situaii de polimedicaie. Mecanismele
farmacocinetice care pot induce interaciuni medicamentoase sunt mai dificil
de prevzut de ctre clinicieni dect interaciunile farmacodinamice care pot fi
2
anticipate pe baza aciunii farmacologice a medicamentelor administrate. Pe

parcursul diferitelor faze ale cineticii medicamentelor, metabolismul i, n
particular, biotransformarile catalizate de citocromii P450 pot conduce la
interaciuni semnificative care se manifest la nivelul absorbiei intestinale sau
al excreiei renale. Majoritatea medicamentelor administrate pe ale oral se
absorb, n principal, n intestinul subire. Alimentele, prezente simultan n tubul
digestiv, pot influena eficacitatea principiilor active medicamentoase prin
diminuarea sau, din contr, intensificarea efectelor terapeutice. Interaciunile
privesc, adesea, absorbia medicamentelor de-a lungul tubului digestiv, dar
anumii nutrieni modific metabolismul i eliminarea medicamentelor.
Alimentele pot influena att viteza de absorbie ct i biodisponibilitatea unui
medicament.
Dintre interaciunile farmacocinetice, mai importante sunt cele care
afecteaz cantitatea de principiu activ absorbia; acestea sunt clinic semnificative
mai ales, pentru medicamentele cu indice terapeutic ngust. In aceste cazuri,
modificarea vitezei de absorbie influeneaza eficacitatea medicamentului.
Influena alimentelor asupra eficacitaii i toleranei medicamentelor este dificil
de prevzut pe baza consideratilor teoretice sau experimentelor in vitro.
Majoritatea datelor disponibile se bazeaza pe studii farmacocinetice pe voluntari
sntoi, la care medicamentele au fost administrate cu sau far alimente; de
obicei, se determin Cmax, tmax i aria de sub curba (ASC). Influena
alimentelor statistic semnificativ este frecvent demonstrat, dar efectele clinice
semnificative sunt rare. Impactul acestor interaciuni asupra eficacitaii
medicamentelor ar fi mai corect documentat prin studii asupra pacienilor
reprezentativi pentru populaia inta de tratat (Dahan et al., 2004).
Mecanismul posibil al interaciunii poate fi inhibarea P-glicoproteinei i
creterea biodisponibilitii orale prin reducerea efluxului intestinal i/sau
hepatic. Cercetri in vitro au demonstrat inhibarea de ctre sucul de grapefruit a
polipeptidelor transportoare de anioni anorganici (OATP); absorbia intestinal
pare s scad pe msura ce biodisponibilitatea oral a fost redus. Mai multe
componente ale sucului de grapefruit sunt considerate rspunztoare de
interaciunea cu medicamentele; unele dintre datele n literatur sunt
controversate i de aceea, este prematur de a trage concluzii.
Flavonoidele (naringina, quercetina, kaemferolul) au fost primele
investigate. Studii in vitro (Bailey et al., 1993) au demonstrat c naringenina,
metabolit al naringinei ar fi un potenial inhibitor al CYP 450 (Miniscalco et al.,
1992). Furanocumarinele, un alt grup de compui din sucul de grapefruit au
demonstrat aciune de inhibare specific a CYP3A4. Wang (Wang et al., 2001) a
semnalat capacitatea furanocumarinelor de a inhiba P-glicoproteinele.
Bergamotina este furanocumarina majoritar n sucul de grapefruit;
metabolitul sau, dihidroxibergamotina, precum i alte patru componente cu
3
structuri asemntoare sunt potenial inhibitoare ale P-glicoproteinei, cnd sunt

prezente simultan n aliment (Edwards et al., 1996; Ohnishi et al., 2000; Mohri et
al., 2001).
Unele cercetri au fost efectuate folosind suc de grapefruit de
concentraie obinuit, in timp ce alte studii au folosit sucuri de grapefruit de
concentraie dubl (sucuri reconstituite cu jumtate din cantitatea de ap
recomandat). O alt diferena ntre metodele utilizate este reprezentat de
cantitatea de SG ingerat (un pahar sau mai multe pahare de suc de grapefruit).
In ciuda rezultatelor care au demonstrat o intensitate mai marea efectelor dupa
administrri repetate de suc de grapefruit, se pare c n cele mai multe cazuri,
ingestia unui singur pahar de suc de grapefruit de concentraie obinuit este
suficient pentru a produce efectul maxim. In acest sens, dup 14 zile de consum
de suc de grapefruit, nu a mai avut loc nici o modificare n farmacocinetica
felodipinei, comparativ cu efectele dupa primul pahar de suc de grapefruit
(Bailey et al., 1993). Efectul sucului de grapefruit dureaza pan la 3 zile. Totui,
se pare c un interval de 24 de ore ntre ingestia de SG i administrarea
medicamentului poate preveni o interaciune relevant d.p.d.v. clinic.
Interesul pentru studierea interaciunii medicamentelor cu sucul de
grapefruit este confirmat de numrul foarte mare de publicaii care semnaleaz
aspecte particulare privind acest tip de interaciuni. Au fost realizate studii
experimentale pe animale de laborator i numeroase studii clinice care
demonstreaz existena interaciunilor cu medicamente din diferite clase
terapeutice: antagoniti ai canalului de Ca, modulatori ai SNC (Hukkinen et al.,
1995; Kupferschmidt et al., 1995; Ozdemir et al., 1998) inhibitori HMG-CoA
reductaza, imunosupresoare, inhibitori ai 5-fosfodiesterazei, antihistaminice,
prokinetice, antiaritmice etc. (Dahan et al., 2004). Numeroase studii se refer la
descifrarea mecanismului prin care componentele sucului de grapefruit intervin
n modificarea biodisponibilitii principiilor active medicamentoase.
Antiinflamatoarele nesteroidiene reprezint una dintre cele mai
utilizate clase de medicamente. Mecanismul principal de aciune al acestor
principii active este inhibarea ciclooxigenazei i a sintezei de prostaglandine i
de ali eicosanoizi ciclooxigenazici. Utilizarea tot mai extins a inhibitorilor
selectivi de Cox-2 (prima generaie: Celecoxib, Rofecoxib) i a doua generaie:
Valdecoxib, Parecoxib, Etoricoxib) necesit, ntre altele, evidenierea
interaciunilor de tip farmacocinetic i farmacodinamic ale acestei grupe de
medicamente (Paulson, 2001).
Pentru medicamentul selectat pentru studiu, diclofenac, datele privind
interaciunile farmacocinetice cu alimentele, n general, i cu sucul de
grapefruit, n special, sunt relativ puine. Mahgoub (2002) a studiat influenta
sucului de grapefruit asupra diclofenacului administrat ca antiinflamator, pe
model inflamator, indus de carageenan; pentru toate concentraiile de
4
diclofenac administrate per os (1 mg, 2,5mg i respectiv 10mg/kg corp),

reducerea volumului edemului a fost prezent i mrit (n proporie de 19
47% ), comparativ cu aceleai doze de diclofenac, administrate fr suc de
grapefruit. Diclofenacul este un antiinflamator nesteroidal cu aciune
antiinflamtoare, analgezic i antipiretic foarte utilizat n Romnia i, de aceea
consideram oportuna evaluarea farmacocineticii interaciunilor dintre
diclofenac i sucul de grapefruit.
Abordarea n mod tiinific a posibilittilor profilactice i terapeutice,
n urma unor studii clinice i experimentale, confer alternativa realizrii unui
management corect al administrrii simultane a sucului de grapefruit i a
diclofenacului, acest antiinflamator nesteroidian mult utilizat n ara noastr
pentru tratamentul bolilor reumatismale, precum i posibilitatea monitorizrii
riguroase a manifestrilor generale.
Datele din literatura de specialitate privind interaciunile poteniale ale
medicamentelor, foarte frecvent utilizate n practica medical, cu alimentele i,
n special cu sucul de grapefruit, sunt total insuficente i de aceea consideram
oportuna evaluarea farmacocineticii interaciunii diclofenac-suc de grapefruit,
prin experimente pe animale de laborator i prin studii clinice.
Identificarea i dozarea substanelor bioactive considerate responsabile
de interaciune (flavonoide, furanocumarine) poate contribui la elucidarea
mecanismului de aciune i modularea intensitii interaciunii.
Rezultatele cercetarilor pot contribui la optimizarea administrrii
medicamentelor, n sensul adaptrii dozelor, n funcie de influena sucului de
grapefruit asupra biodisponibilitaii medicamentului administrat simultan.
Considerm de asemenea c este oportun, studierea unitar a acestor
interaciuni i prin faptul c att medicul, care prescrie medicamentul, ct i
farmacistul care l elibereaz pacientului, trebuie s cunoasc n detaliu aspectele
privind modificarea biodisponibilitaii medicamentelor n scopul obinerii
maximului de eficiena terapeutic i reducerea efectelor secundare i adverse.
Originalitatea cercetrii este consecutiv originalitii domeniului; n
cercetarea biomedical o perioad de timp de 15 20 de ani (de la prima
semnalare a interaciunilor medicamentelor cu sucul de grapefruit) nu este
suficient pentru abordarea tuturor aspectelor generale sau particulare aprute;
n plus, sunt introduse n terapeutia noi medicamente (inhibitorii selectivi de
ciclooxigenaza etc) pentru care studiile de farmacocinetic trebuie
diversificate. Astzi, studiile de farmacocinetic beneficiaz din plin de
progresele spectaculoase din domeniul chimiei analitice (metode
HPLC/MS/MS, GS/MS) care fac posibil determinarea concentraiilor serice
ale principiilor active cu mare, mare precizie.
Cuprinderea i rezolvarea complet a interaciunilor i incompatibilitilor
care pot s apar, este o sarcin nerezolvat, fiind ns necesare cunostine ct mai
5
temeinice privind rezultatele asocierilor medicamentoase, a interaciunilor i

efectelor acestora asupra raspunsului terapeutic.
Publicaiile de specialitate semnaleaz din ce n ce mai des, importana
cunoaterii faptului c anumite alimente ar trebui evitate n timpul unui
tratament medicamentos pentru a optimiza eficacitatea terapeutic a
medicamentelor. Hotrarea nr. 21/22.05.2006 referitoare la aprobarea Ghidului
pentru elaborarea raportului de evaluare privind documentaia clinic, adoptat
de Consiliul tiinific al A.N.M. n capitolul II.1.3. precizeaz: se includ date
referitoare la interaciuni medicament-aliment.
Cert este faptul c nu se poate renuna la medicamente atunci cnd
sunt necesare i nici la alimente pe perioada tratamentului medicamentos.
Singura regul care poate fi aplicat rmne informarea corect i complet
asupra medicamentului care urmeaz a fi utilizat i daca nu dispunem
ntotdeauna de datele necesare, ca profesioniti n domeniul medicamentului,
este corect s respectm i s indicm pstrarea unui interval de 2-3 ore ntre
administrarea medicamentelor si a alimentelor, ca masura minima de siguranta.
Lucrarea de fata a fost intocmita pe baza unui studiu minuios al
literaturii de specialitate care a permis iniierea i dezvoltarea cercetrilor
incluse n obiectivele tezei de doctorat.
Am dorit i sper ca aceast lucrare s se inscrie cu titlul unei mici i
modeste contribuii la efortul general ntreprins pentru a se asigura o folosire
raional a arsenalului terapeutic actual i pentru a se evita accidentele produse
de o medicaie activ, ntr-un context alimentar inadecvat.
I.3. OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT
n contextul actual generat de importana descifrrii mecanismelor
interaciunii aliment medicament, n general, i a interaciunilor
farmacocinetice manifestate la consumul de suc de grapefruit simultan cu
administrarea unor medicamente, n particular, prezent tez de doctorat i
propune ca obiective:
9 Validarea unei metode HPLC de dozare a diclofenacului din plasma de
obolan;
9 Studiul experimental al interaciunii farmacocinetice suc de grapefruit diclofenac, la animale de laborator;
9 Evidenierea i determinarea cantitativ a unor componente bioactive din sucul
de grapefruit (flavonoide, furanocumarine), responsabile de producerea
interaciunii;
9 Studiu preliminar privint interaciunea diclofenacului cu alte sucuri de fructe;
9 Formularea mecanismului interaciunii dintre sucul de grapefruit i diclofenac
pe baza parametrilor farmacocinetici determinai experimental.
6
Capitolul II
II.1. INTERACIUNI ALIMENT MEDICAMENT. ASPECTE
GENERALE
Terapia medicamentoasa constituie baza tratamentului majoritii
mbolnvirilor i const n intervenia medicului, care prin competena sa
instituie o conduit terapeutic adecvat, care incepe cu anamneza i se
finalizeaz, n cele mai multe cazuri, cu nmanarea reetei ctre pacient.
Cel puin teoretic, trebuie admis, ca orice medicament reprezint o
substan toxic, n msura n care acesta reclam un efort metabolic necesar
procesului de transformare, de adaptare a sa la organism, de nsuire a efectului
terapeutic. Medicul practician i farmacistul trebuie sa cunoasc din ce n ce
mai multe notiuni privind asocierea medicamentelor (al caror numr este n
permanent crestere) i a posibilelor interaciuni i incompatibiliti.
Studiile asupra efectelor reciproce care pot fi exercitate de ctre
medicamente i alimente asupra diferitelor funcii ale organismului pot fi
considerate recente. n prezent se recunoate necesitatea de a stabili o
metodologie de studiu a eventualelor interaciuni medicament-aliment, studii
efectuate att pe animale de laborator, ct i studii clinice, dei se tie c
aceast metodologie nu este uor de stabilit i nici de urmat n toate cazurile.
De aceast problem s-a preocupat ndelung Roe et al., (1981) care i-a
publicat studiile n primul numr al revistei Drug Nutrient Interaction nc
din anul 1981. Acest autor semnaleaz faptul c pentru a putea cunoate i
interpreta posibilele influene ale alimentaiei asupra activitii farmacologice a
medicamentelor, este necesar s inem cont de:
Factori dietetici care pot influena biodisponibilitatea medicamentelor;
Efectele dietei asupra metabolismului microbian al xenobioticelor;
Relaiile care pot exista ntre alimente i mutagenitate, teratogenitate i
carcinogenez;
Existena unor nutrimente cu proprieti terapeutice (alimente
medicamente);
Interaciunile alcoolului cu medicamentele i, de asemenea,
interaciunile acestuia cu alimentele;
Influena pe care o poate exercita medicamentul asupra digestiei
alimentelor, asupra greutii corporale, asupra necesarului nutritiv i
asupra creterii organismului;
Posibilele efecte adverse sau benefice ale medicamentelor asupra
absorbiei, transportului, metabolizrii, utilizri celulare i excreiei
nutrimentelor;
Eventuala prezen a substanelntinutritive n alimente;
7
Efectele malnutriiei asupra absorbiei, transportului, metabolizrii i

toleranei medicamentelor;
Factorii care determin malnutriia indus de alcool i/sau de
medicamente.
II.2. INTERACIUNI ALIMENT-MEDICAMENT. DOMENII

DE INTERES
Interaciunile aliment medicament sunt definite ca o interaciune
rezultat dintr-o relatie fizic, chimic, fiziologic, fiziopatologic ntre un
medicament i un nutrient, o asociere de nutrieni, produsele alimentare, n
general sau cu starea de nutriie a organismului, global. O interaciune este
considerat a fi semnificativ clinic n cazul n care altereaz un rspuns
farmacoterapeutic sau compromite statusul nutriional al organismului
(Boullata, 2010).
Consecinele clinice ale interaciunii se refer la perturbarea distribuiei
medicamentelor sau nutrienilor. Farmacocinetica (disposition) include
absorbia, distribuia i eliminarea unui medicament sau unei substane nutritive
i implic transportorii fiziologici i enzime metabolizante. Efectul pe termen
lung al interaciunilor aliment-medicament se refer la aciunea fiziologic a unui
medicament sau substane nutritive la nivel celular sau chiar subcelular.
Interaciunile medicament-nutrient pot influena sntatea organismului, n
special la categoriile de populaiei vulnerabile (Kordas et al., 2007).
Mai muli factori pot influena riscul de dezvoltare a unei IAM cu
semnificaie clinic. Printre acetia amintim pacienii cu patologie cronic care
folosesc mai multe medicamente simultan, n special din categoria celor cu
indice terapeutic ngust (Salazar et al., 2007). Prevalena consumului de
medicamente la vrstnici este recunoscut i are drept consecine frecvena
crescut a efectelor secundare mai severe, precum i riscul dezvoltrii
interaciunilor aliment - medicament. La acestea se adaug caracteristicile
genetice ale organismului, precum i polimorfismul transportorilor, enzimelor,
receptorilor, afectarea funciei unor organe, statusul nutritional perturbat la
persoanele vrstnice. Perturbarea statusului nutriional se refer la dezechilibre
metabolice provocate de aport alimentar inadecvat sau de instalarea unor
alterri ale metabolismului unor principii nutritive.
Interaciunile medicament-nutrient pot fi evaluate ca perturbri n
farmacocinetica i, mai rar n aciunea farmacodinamic a medicamentului.
Medicamentele i substanele nutritive pot influena parcursul semnalului de
transducie cu impact asupra enzimelor care metabolizeaz medicamentele i
asupra transportorilor prin expresia genelor receptor-mediate (Rushmore, 2002;
Gillies, 2007). In plus, este cunoscut faptul c unele medicamente servesc ca
substrat, inductori sau inhibitori ai transportorilor, ai enzimelor din diferite esuturi,
8
cu dezvoltarea unor interaciuni directe sau indirecte cu nutrienii; aceste

interaciuni trebuie cunoscute sau prevzute pentru a le diminua impactul asupra
organimului n care se produc. Interaciunile farmacocinetice pot implica enzime i
transportori care particip la absorbia, distribuia sau eliminarea medicamentului.
Interaciunile farmacocinetice sunt cel mai bine definite ca schimbri ai
parametrilor medicamentelor sau nutrienilor (biodisponibilitatea, volumul de
distribuie, clearance-ul). Interaciunile farmacodinamice implic efectul clinic al
unui medicament, respectiv cel fiziologic al unui nutrient. Interaciunile
farmacodinamice sunt cel mai pregnant caracterizate prin evaluarea cantitativ i
calitativ a aciunii medicamentelor i a statusului nutriional al organismului.
II.3. INFLUENA MEDICAIEI ASUPRA STATUS-ULUI
NUTRITIV AL ORGANISMULUI
Influena medicaiei asupra status-ului nutritiv al organismului privind
nutrieni specifici poate fi, de asemenea, multifactorial (Boullata, 2005).
Medicamentele pot influena absorbia nutrienilor, distribuia, metabolismului i
excreia acestora. Semnificaia schimbrilor n starea substanelor nutritive, ca
urmare a utilizrii medicamentelor este apreciat prin evidenierea unor markeri
individuali. n plus, orice manifestare clinice poate fi mai mult specific unui
anumit pacient dect specific administrrii unui medicament. Dezvoltarea unui
sindrom clasic consecutiv unui deficit de nutrieni nu poate fi considerat rezultat al
unei interaciuni de tip aliment medicament. Conceptul c unele efecte adverse ale
medicamentelor sunt direct legate de influena lor asupra statusului nutriional al
organismului nu este nou. Carenele nutriionale asociate consumului de
medicamente pot fi considerat o subclas de efecte adverse legate de doz, de
durata administrrii medicamentului sau chiar fenomene de idiosincrazie.
II.4.INTERACIUNI SUC DE GRAPEFRUIT MEDICAMENTE
II.4.1. Istoric
Un studiu experimental privind posibile interaciuni ntre ingestia de
alcool i felodipina a evideniat interaciunea sucului de grapefruit cu blocanii
canalelor de calciu, sucul de grapefruit fiind folosit pentru mascarea gustului
neplcut al alcoolului. Ingestia simultana de doze netoxice de etanol i de
felodipina au condus la concentraii crescute de felodipina. i alte studii privind
farmacocinetica felodipinei administrat simultan cu sucul de grapefruit au condus
la aceleai rezultate (Bailey et al., 1989).
Dei un accident, descoperirea ca sucul de grapefruit poate crete
disponibilitatea unor medicamente administrate pe cale oral (i deci i o sporire a
efectelor lor farmacodinamice), a trezit un interes deosebit; aceste observaii
surprinztore au condus la continuarea cercetrilor, cercetri care au confirmat ca
sucul de grapefruit poate creste dramatic biodisponibilitatea felodipinei i c poate
9
influena parametrii farmacocinetici i farmacodinamici i pentru alte medicamente

(Bailey, 1991).
Au urmat numeroase publicaii privind interaciunea sucului de grapefruit
cu diferite medicamente, cu accent pe aspecte diferite: mecanismul interactiunii,
componentele sucului de grapefruit responsabile de interactiune, relevanta clinica,
etc., publicaii care semnaleaz aspecte particulare privind acest tip de interactiuni
si care confirma interesul pentru studirea interaciunii medicamentelor cu sucul de
grapefruit.
Au fost realizate studii experimentale pe animale de laborator i
numeroase studii clinice care demonstreaz existena interaciunilor cu
medicamente din diferite clase terapeutice: antagoniti ai canalului de Ca,
modulatori ai SNC (Hukkinen et al., 1995; Kupferschmidt et al., 1995; Ozdemir et
al., 1998) inhibitori HMG-CoA reductaza, imunosupresoare, inhibitori ai 5fosfodiesterazei, antihistaminice, prokinetice, antiaritmice etc. (Dahan et al., 2004).
O alt diferen ntre metodele utilizate este reprezentat de cantitatea
de suc de grapefruit ingerat (un pahar sau mai multe pahare de suc de
grapefruit). Unele cercetri au fost efectuate folosind suc de grapefruit de
concentraie obinuit, n timp ce alte studii au folosit sucuri de grapefruit de
concentraie dubl (sucuri reconstituite cu jumtate din cantitatea de ap
recomandat).
II.4.2. Suc de grapefruit: compozitie chimic
II.4.2.1. Arborele de grapefruit
Arborele care produce grapefruitul - Citrus paradisi - este un arbore
din familia Rutaceae, genul Citrus. Arborii de grapefruit au fost semnalai
pentru prima dat n Barbados, n jurul anului 1750; fructele erau cunoscute
sub numele de fructul oprit. Doar dup civa ani s-au observat crescnd n
Jamaica, dar termenul de grapefruit nu a fost folosit pn n 1814. Numele
dat reflect felul n care sunt aranjate fructele n copac atrnnd n
mnunchiuri precum strugurii (engl. grapes = struguri).
Termenul "grapefruit" dateaz din 1665 i provine din Pompelmoes,,
Pompel, pais et limoes, citron. "Pomelo" este un cuvnt preluat din limba
englez (unde apare scris pummelo), el nsui provenit din limba latin
tiinific din pomum melo nsemnnd pomme melon, adic "mr pepene
galben" latin. n limba francez cuvntul a fost introdus n anul 1912, specia
botanic n-a fost recunoscut ca o specie distinct pn n secolul al XIX-lea.
Grapefruitul veritabil are origine oriental. Grapefruitul se deosebete
de pomelo prin dimensiunea sa mare (diametrul de 13 cm i chiar mai mult), de
unde denumirea n limba latin: Citrus maxima sau C. Grandis; forma de par
nu este ntotdeauna prezent (Carrington et al., 2003).
10
II.4.2.2. Componente bioactive din sucul de grapefruit

Mai multe studii epidemiologice arat o relaie invers ntre consumul
de fructe i legume i a incidenei bolilor cronice, cum ar fi bolile
cardiovasculare i unele maladii neoplazice. (Cerda et al., 1994). Aceast relaie
de proporionalitate invers a fost confirmat de multe studii n care consumul de
citrice afost legat de prevenirea anumitor tipuri de cancer (inclusiv cancere ale
cavitii bucale, faringelui, esofagului, stomacului) (So et al., 1996; Guthrie,
1998). Mai multe componente bioactive cum ar fi flavonoide, limonoide,
vitamina C si carotenoide, ar putea juca un rol important n aceste efecte.
II.4.3.1. Citocrom P450 (CYP), enzime, interaciuni medicamentoase
i interaciuni aliment medicament
Metabolismul medicamentelor are loc n principal n ficat, dei alte
organe cum ar rinichii, plmnii i tractul gastro-intestinal pot contribui la reacii
de biotransformare (Krishna et al., 1994). Administrate pe cale oral,
medicamentele trebuie s traverseze peretele intestinal, sistemul hepatic portal i
ficatul nainte de a ajunge n circulaia sistemic. n cazul n care un medicament
este supus biotransformrii extinse n ficat, numai o fraciune din doz va ajunge
n circulaia sistemic i, n cele din urm, n site-ul su de aciune.
Acest fenomen este cunoscut ca proces de metabolizare la nivelul
primului pasaj hepatic. Termenul "extraction ratio" definete fraciunea de
medicament ndeprtat din snge n timpul unui singur tranzit prin ficat.
Corespunztor, medicamentele care sunt supuse unei ample metabolizri la nivelul
primului pasaj au extraction ratio ridicat.
Metabolizarea la primul pasaj poate reduce n mod semnificativ
biodisponibilitatea unor medicamente, chiar dac absorbia este complet. Ca i
la nivelul ficatului, medicamente administrate oral pot fi supuse
metabolismului la nivelul peretelui intestinal nainte de a ajunge n circulaia
sistemic. Pentru unele medicamente (mai ales substraturi ale CYP3A4)
metabolizarea presistemic n intestin poate fi un factor determinant pentru
biodisponibilitatea lor (Paine et al., 1996; Thummel et al., 1996).
II.4.3.2. Transportori de medicamente sau /i de xenobiotice
Medicamentele i xenobioticele pot produce o inhibare reversibil sau
ireversibil a enzimelor CYP i, astfel, pot preveni biotransformarea substraturilor.
n inhibarea reversibila, compuii lipofili se leag covalent de site-ul activ al
enzimei. Acest lucru previne legarea altor molecule ale substratului pe regiunile
active hidrofobe ale apoproteinei CYP sau activarea hemului CYP de ctre oxigen.
Ambele aciuni rezult din inhibarea tranzitorie, dei uneori este potenat
activitatea enzimei (Murray, 1999). Inhibitorii competitivi sunt de multe ori, dar nu
neaprat substraturi pentru enzima pe care o inhib. Inhibitorii tipic competitivi ai
11
enzimelor CYP includ antifungice cu structur imidazolic ketoconazol i

itraconazol i, respectiv inhibitori de proteaz, ritonavir (Back et al., 1991; Eagling
et al., 1997).
Inhibarea ireversibil a enzimelor CYP, mecanism numit "inhibare sinucidere" mecanism based inhibition se poate manifesta ca inactivare
autocatalitic i complexare metabolit intermediat. Inactivarea autocatalitic sau
inhibarea de sinucidere are loc atunci cnd un metabolit reactiv al medicamentului,
format n etapele anterioare catalizate de o enzima CYP, se leag de aceast enzim
i modific structura sa, ducnd la pierderea ireversibila a funciei.
II.4.4. Mecanisme de inhibiie a enzimelor citocromului P450
Inhibarea enzimelor metabolice, n special cele ale sistemului P450,
reprezint o preocupare permanent pentru industria farmaceutic pentru dou
motive; pe de o parte, inhibarea enzimei poate determina interaciuni
medicamentoase atunci cnd dou sau mai multe medicamente sunt administrate
simultan, iar pe de alt parte, unele izoenzime specifice ale citocromului P450 pot
fi considerate ca inte terapeutice. Un exemplu este CYP19 (aromataz) (Koymans,
1995), care catalizeaz aromatizarea androgenilor n estrogeni a cror inhibiie este
util n tratamentul cancerului de sn (Brueggemeier, 2001). Inhibiia aromatazei
este un tratament utilizat pe scar din ce n ce mai larg n terapie; exist multe
studii clinice cu privire la utilizarea unor compui care au ca mecanism de aciune
inhibarea aromatazei (Brueggemeier, 2005; Carlini, 2005; Ziegler, 2005).
Inhibarea unor izoforme ale citocromilor P450 ca inte terapeutice nu sunt
nc metode terapeutice aplicate n practica clinic.
II.4.5. Efectele sucului de grapefruit asupra metabolismului
medicamentelor
n anii '90, Bailey et al. (1991) au raportat pentru prima dat
interaciunea sucului de grapefruit-medicamente observate ntre sucul de grepfrut
i felodipin, un blocant dihidropiridinic al canalelor de calciu (Bailey et al.,
1991). ntr-un studiu clinic cu pacienii hipertensivi, la care s-au administrat 250
ml suc de grapefruit dublu concentrat s-a observat triplarea ariei de sub curb
pentru felodipin, comparativ cu lotul control (Bailey et al., 1991). n paralel, a
crescut concentraia plasmatic maxim (Cmax) a felodipinei; timpul de
njumtire a rmas neschimbat. ASC pentru a dehidrofelodipin, metabolitul
principal al felodipinei, a fost, de asemenea crescut de sucul de grapefruit. Cu
toate acestea, raportul ASC dehidrofelodipine/felodipin a fost mai mic la
administrarea sucului de grepfrut dect la lotul control. Felodipina este, de obicei
complet absorbit din tractul gastro-intestinal (Edgar et al., 1985). Cu toate
acestea, datorit metabolizrii sale presistemice, biodisponibilitatea absolut este
de aproximativ 15%, cu considerabile variaii interindividuale. Oxidarea
12
felodipinei la dehidrofelodipin i a acesteia, mai departe ntr-un metabolit

secundar sunt catalizate de CYP3A4, care este exprimat abundent att n zona
apical a enterocitelor din intestinului subire ct i n hepatocite. Astfel,
rezultatele obinute de Bailey et al (1991) indic faptul c sucul de grapefruit
inhib att mecanismul principal de metabolizare a felodipinei ct i ulterior
calea de metabolizare a dehidrofelodipine. n plus, s-a nregistrat o corelaie ntre
concentraiile plasmatice ale felodipinei i efectele farmacodinamice ale acesteia:
scderea tensiunii arteriale, intensificarea activitii cardiace precum i creterea
frecvenei reaciilor adverse (vasodilataie) (Bailey et al., 1991). Deoarece sucul
de grapefruit nu a modificat farmacocinetica felodipin administrate intravenos,
s-a emis ipoteza c interaciunea acesteia cu sucul de grapefruit se datoreaz
inhibrii metabolismului presistemic al medicamentului (Lundahl et al., 1997).
Mecanismul de aciune probabil n producerea interaciunii sucului de
grapefruit cu diferite medicamente este inhibarea metabolismului mediat de
CYP3A4 la nivelul primului pasaj, n peretele intestinal. Cercetrile realizate
de Lown et al., (1997) a ofer sprijin n favoarea acestei ipoteze. n acest
studiu, realizat in vivo, consumul de suc de grapefruit timp de 5 zile a
determinat o reducere de 62% a proteinelor CYP3A4 din enterocitele de la
nivelul intestinal. De asemenea, a avut loc o cretere de 3 ori a ASC pentru
felodipin i de 5 ori a Cmax, respectiv. n schimb, nu a avut loc modificarea
nivelului CYP3A4 mRNA la nivel intestinal sau hepatic, a activitii CYP3A4,
a glicoproteinei P la nivel intestinal sau a CYP3A5 la nivelul colonului.
Mai mult, nivelui intestinal al CYP2D6 i CYP1A1 a rmas neschimbat.
Aceste observaii au dus la concluzia c scderea expresiei CYP3A4 n peretele
intestinal n urma consumului de suc de grapefruit nu se bazeaz numai pe
inhibarea competitiv. Deoarece nivelul CYP3A4-ARNm n intestinul subtire nu
s-a modificat, se sugereaz c sucul de grepfrut a redus, probabil, coninutul de
proteine CYP3A4 prin mecanism posttranscriptional, eventual prin degradarea
accelerat a CYP3A4 prin mecanismul inhibiie-sinucidere. Astfel, restaurarea
activitii CYP3A4 ar necesita sinteza de novo a enzimelor (Lown et al., 1997).
Rezultatele sunt n concordan cu studiile realizate de Lundahl et al. (1995), care
a artat c efectul unei doze unice de suc de grapefruit asupra farmacocineticii
felodipinei este prezent chiar i atunci cnd sucul a fost consumat cu 24 de ore
nainte de administrarea medicamentului.
Dei sucul de grapefruit nu a afectat concentraia de P-gp in intestinul
subire, funcia acestei proteine transportoare se poate modifica n alt mod.
Componentele grapefruitului inhib funcia P-gp n celulele CaCO-2 in vitro; n
plus, inhibarea P-gp poate fi responsabil pentru efectul sucului de grapefruit
asupra farmacocineticii ciclosporinei in vivo (Takanaga et al., 1998;. Edwards et
al., 1999).
13
II.4.5.1. Ingrediente active din sucul de grapefruit flavonoide i

furanocumarine
Sucul de grapefruit (Citrus paradisi) conine numeroase componente
flavonoidice structural diferite; multe dintre acestea se gsesc n alte plante
(unele cunoscute i utilizate ca plante medicinale) i fructe. Flavonoidul cel
mai des ntlnit n sucul de grapefruit este naringina, considerat responsabil
de gustul amar al unor pri ale fructului; concentraiile de naringin variaz pe
o palet foarte larg de valori n intervalul 100-800 mg/L, pentru produsele
preparate n gospodrie i consumate imediat i 200 mg/L - 500 mg/L n
preparate comerciale de suc de grapefruit (Ameer et al., 1996; Hagen et al.,
1965; Kupferschmidt et al., 1995). Alte flavonoide prezente n fructul de
grapefruit i implicit n suc, mai ales sub form de glicozide includ narirutin,
hesperidina, quercetin, kaempferol, i apigenina (Guengerich et al., 1990).
Naringina i agliconul su naringenina sunt cunoscute ca inhibitori
competitivi ai CYP3A4, mediatori ai metabolizrii medicamentelor n
microzomii hepatici umani (Guengerich et al., 1990; Miniscalco et al., 1992.).
Pe baza acestei proprieti a naringinei i pe existena sa n suc ca
reprezentant cantitativ a flavonoidelor s-a formulat mecanismul prin care se
produce interaciunea farmacocinetic dintre sucul de grapefruit i medicamente.
Mai mult dect att, naringina este absent din sucul de portocale, pentru
care, la un moment dat s-a demonstrat c nu afecteaz farmacocinetica
felodipinei sau a ciclosporinei (Bailey et al., 1991; Yee et al., 1995).
Naringenina, agliconul naringinei este eliberat din glicozid prin scindarea
enzimatic a componentei glucidice, eventual n intestinul subire; ulterior
aceasta este supus conjugrii cu acidul glucuronic (Fuhr et al.,1995). In vitro,
naringenina este confirmat ca inhibitor al metabolismului medicamentelor mai
activ dect naringina. n studiile in vivo, naringenina nu a fost evideniat n
plasm; compusul excretat pe cale renal are concentraii reduse, comparativ cu
doza de naringin administrat, n timp ce glucuronoconjugatul naringeninei a
avut concentraii mai mari n plasm i n urin. Aceste variaii ale distribuiei i
eliminrii naringeninei au sugerat c efectul inhibitor al acestor flavonoizi
prezeni n sucul de grapefruit se manifest la nivelul intestinului subire. Cu
toate acestea, naringina administrat sub form de soluie apoas sau sub form
de capsule, n concentraiile n care este prezent n sucul de grapefruit nu a
afectat farmacocinetica dihidropiridinei in vivo (Bailey et al., 1993).
Cvercetina este un alt compus flavonoidic al sucului de grapefruit (Fig
II.10) care acioneaza ca un inhibitor potent al CYP3A4 in vitro. Nefiind un
compus specific pentru sucul de grapefruit rolul lui n producerea interaciunilor
farmacocinetice aliment - medicament nu a fost aprofundat. Mai mult, in vivo
quercetina nu a afectat farmacocinetica nifedipinei (Rashid et al., 1993).
14
Aprofundarea cercetrilor n scopul descifrrii mecanismului

interaciunilor farmacocinetice aliment-medicament, a componentelor responsabile
i a intensitii acestui fenomen care ar putea avea semnificaii clinice severe a
condus la orientarea ateniei spre un alt grup de componente ale fructelor citrice, i
n special a fructelor de grapefruit. Astfel, Edwards et al., (1996) au demonstrat c
6', 7'-dihidroxi-bergamotina, furanocoumarina major n sucul de grepfrut
(extractibil n clorur de metilen) poate inhib formarea de 6-hidroxi-testosteron
mediat de CYP3A4 n microzomii hepatici de obolan. Studii ulterioare au
confirmat c 6',7'-dihidroxi-bergamotina determin o scdere dependent de doz a
activitii catalitice a CYP3A4 uman i a imunoreactivitii acestei enzime
(Schmiedlin-Ren et al., 1997).
II.5.ANTINFLAMATOARE NESTEROIDIENE DICLOFENAC.
ASPECTE GENERALE
Antinflamatoarele nesteroidiene (AINS) reprezint una din cele mai
utilizate clase de medicamente care nsumeaz proprietai analgezice,
antipiretice i antiinflamatorii, cu caracter simptomatic. Prototipul este acidul
acetilsalicilic care prezint toate aceste efecte de intensitate moderat. Ele sunt
folosite n diferite boli inflamatorii, mai ales n afectiunile reumatice i sunt
denumite astfel pentru a fi deosebite de antiinflamatoarele steroidiene
reprezentate de glucocorticoizi.
Diclofenacul se absoarbe repede i complet din tubul digestiv (100% dup
administrare oral), dar disponibilitatea sistemic este de aprox. 50%, restul fiind
metabolizat la primul pasaj hepatic. Concentraiile plasmatice maxime sunt atinse
n curs de 2 ore dupa administrarea oral; concentraiile plasmatice utile: 1-3
ug/ml. Dozele repetate nu conduc la acumularea de diclofenac n plasm.
Farmacocinetica diclofenacului a fost studiat dup administrarea i.v. rapid i
dup o doz oral unic la voluntari sntoi. 50% din doza oral absorbit nu
ajunge n circulaia sistemic, ceea ce reflect un efect de prim pasaj. Se leag de
proteinele plasmatice n proporie de 99,7% (n special de albumin). Timpul de
njumtaire plasmatica este de 1-2 ore, dar medicamentul se menine mai mult n
lichidul sinovial dect n plasm (pn la 11 ore). Nu este detectabil n laptele
matern. Metabolizat n proporie mare n ficat, prin glucuronoconjugare i
hidroxilare (fenil hidroxilarea diclofenacului este catalizat de CYP P450 3A4 si
2C9). Metaboliii se elimin 2/3 prin urin i 1/3 prin bil. Un metabolit principal
la om este compusul 4-hidroxi-diclofenac. Aproximativ 90% din doza oral este
excretat n primele 96 de ore dup administrare (Dictionar Vidal,
http://www.vidal.fr/).
Diclofenacul (n toate formele), este contraindicat la pacienii cu
hipersensibilitate cunoscut la diclofenac i produse care conin diclofenac.
Diclofenac nu trebuie administrat la pacienii care au prezentat astm bronic,
15
urticarie, sau reactii de tip alergic dup ce au luat aspirin sau alte AINS (reacii
severe, rareori fatale).
Simptomele de supradozare includ pierderea cunotinei, cresterea
presiunii intracraniene si pneumonie de aspiraie; DL 50: 390mg/kg (pe cale
oral, la oareci).
Datele din literatura de specialitate privind interaciunile poteniale
medicament - aliment, n general i medicamente suc de grapefruit n special,
sunt total insuficente i de aceea considerm oportuna evaluarea farmacocineticii
interaciunii diclofenac - suc de grapefruit, prin experimente pe animale de
laborator i prin studii clinice. Rezultatele cercetrilor pot contribui la optimizarea
administrrii medicamentelor, n sensul adaptrii dozelor, n funcie de influena
sucului de grapefruit asupra biodisponibilitaii medicamentului administrat
simultan. Interesul tiinific pentru studierea interaciunilor dintre sucul de
grapefruit i medicamente cu administrare oral din numeroase clase terapeutice
este confirmat de numrul foarte mare de publicaii care rapoteaz rezultatele
cercetrii farmacocineticii acestor interaciuni prin experimente pe animale de
laborator sau prin studii clinice pe subieci sntoi. Pentru medicamentul selectat
pentru studiu (Diclofenac), datele prind interaciunile farmacocinetice cu
alimentele, n general, i cu sucul de grapefruit, n special, sunt relativ puine
(Mahgoub, 2002).
Capitolul III
STUDIUL INTERACIUNII FARMACOCINETICE DINTRE
DICLOFENAC I SUCUL DE GRAPEFRUIT
Obiective
Validarea metodei HPLC de determinare a diclofenacului din plasma
de obolan.
Studiul experimental al interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac
i sucul de grapefrut.
III.2.4. Raport de validare
Parametri de performant ai metodei analitice care s-au evaluat:
specificitate, liniaritate, limita inferioar de cuantificare, precizie i acuratee,
regsirea, validarea diluiei probelor biologice
Rezultatele validrii i concluzii
III.2.4.2. Specificitatea:
Nu au fost observate interferene la timpul de retenie al diclofenacului
(1.9 minute). (Fig. III.7). In fig.III.8 este prezentat cromatograma unei probe
cu diclofenac la limita de cuantificare (48.7 ng/ml plasma).
16

Intens.
5000
4000
3000
2000
1000
0
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Time [min]
Fig.III.7. Blank de plasma pentru testarea specificitatii

Intens.
x104
1.5
1.0
0.5
0.0
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Time [min]
Fig.III.8. Cromatograma unei probe cu diclofenac, la limita de cuantificare

III.2.4.3. Liniaritatea
Curbele de calibrare au fost liniare cu precizie i acuratee
corespunztoare- n intervalul de concentraii 48.7-3120 ng/ml. (Tabel III.7).
Coeficienii de corelare au fost mai mari dect 0.995. Concentraiile recalculate pe baza curbei ce calibrare demonstreaz c rezidualii nu au o anume
tendin raportat la concentraie. O curb de calibrare a analitului n matrice
este prezentat n figura III.9.
Fig.III.9. Curba de calibrare a diclofenacului

17
III.2.4.4. Limita inferioar de cuantificare

Limita inferioar de cuantificare (cel mai sczut nivel la care
acurateea i precizia nu depesc +/-20%) a fost de 48.75 ng/ml diclofenac.
Precizia i acurateea pentru determinri n aceeai zi au fost de 7.0%
i 12.9%.
Precizia i acurateea pentru determinri n zile diferite au fost de
18.9% i 4.1% (Tabelele III. 8; III.9).
Tabel III.8
Acuratetea, precizia si regasirea pentru determinari in aceeasi zi
Concentratia
Concentratia
Acuratetea
masurata ng/ml ( Precizia %
nominala ng/ml
%
D.S.)
48.75
55.03
3.85
7.0
12.9
146.25
154.67
12.01
7.8
5.8
292.50
288.26
12.79
4.4
-1.4
585.00
608.63
29.71
4.9
4.0
Regasirea % ( D.S.)
90.1
106.0
90.7
101.1
8.2
9.0
4.1
5.0
Tabel III.9
Acuratetea, precizia si randamentul pentru determinari in zile diferite
Concentratia
Acuratetea
Concentratia
masurata ng/ml (
Regasirea % ( D.S.)
Precizia %
%
nominala ng/ml
D.S.)
48.75
46.75
8.82
18.9
-4.1
83.4
9.4
146.25
155.79
4.20
2.7
6.5
103.1
11.8
292.50
302.03
13.44
4.4
3.3
99.9
6.6
585.00
621.46
14.96
2.4
6.2
100.9
6.3
III.2.4.5. Precizia i acurateea

Precizia i acurateea pentru cele trei niveluri testate au fost mai mici
dect +/- 15%, att pentrru determinrile n aceeai zi ct i pentru cele din zile
diferite (Tabelele 2 si 3).
III.2.4.6. Regsirea
Regsirea medie a analitului variaz ntre 83% si 106% pentru limita
de cuantificare i cele trei niveluri de concentraii de control testate.
III.2.4.7. Validarea diluiei
Diluiile analitului n matricea biologic se poat face cu un coeficient
de variaie sub 8.47% i o acuratee sub 6.3% , pentru determinri n aceeai
serie sau serii diferite.
18
III.3. STUDIUL INTERACIUNII FARMACOCINETICE

DINTRE DICLOFENAC I SUCUL DE GRAPEFRUI
III.3.2. Aplicarea modelului experimental. Etapa clinic
Determinarea concentraiei principiului activ n plasma sngelui de
obolan a relevat diferene total nesemnificative ntre cele trei moduri de
administrare a diclofenacului i a sucului de grapefruit.
n continuare, studiul farmacocinetic Diclofenac suc de grapefruit
a fost realizat pe dou loturi a cte 30 de obolani.
Lotul I, a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de grapefruit, proaspt
preparat prin presarea manual a fructelor (grapefruit rou), i dup 30 de
minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp.
Deoarece, n etapa preliminar a studiului s-a stabilit c dup 12 ore de la
administrare, diclofenacul nu mai este prezent n plasm, recoltarea sngelui
(din plexul orbital) s-a realizat la intervale de 30, 60, 90, 120 minute, 3h, 4h,
6h, 8h, 10 h i 12 ore de la administrarea medicamentului. Pentru fiecare
interval de timp s-au recoltat probe de snge de la 5 animale. Sngele a fost
centrifugat imediat dup recoltare, iar plasma a fost pstrat la congelator (- 36
grade C) pna la analiza HPLC/MS, prin metoda de dozare validat anterior.
Lotul II a primit cte 2 ml ap i, dup 30 de minute 10 mg
diclofenac/kg. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n
aceleai condiii cu cele de la lotul I.
III.3.3. Etapa analitica. Rezultate
Pentru dozarea diclofenacului din plasma de sobolan s-a folosit
cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de
masa (HPLC-MS), metoda standardului extern. Metoda a fost validat conform
protocoalelor n vigoare pentru stabilirea condiiilor de aplicare a metodelor
HPLC.
III.3.4. Etapa farmacocinetic
Profilurile plasmatice suprapuse ale diclofenacului, n funcie de
perioada de administrare (cu sau fr sucul de grapefruit), sunt prezentate n
Fig. III:10 (grafic cartezian) respectiv Fig III.11 (grafic logaritmic), n=5.
19

3500
diclofenac singur
Concentratia diclofenac (ng/ml)
3000
diclofenac + suc de grapefruit
2500
2000
1500
1000
500
0
0
6
8
Timp (ore)
10
12
14
Fig. III.10. Profiluri plasmatice ale diclofenacului administrat singur,

respectiv mpreun cu sucul de grapefruit, grafic cartezian, n=5
Discuii. Mecanismul interaciunii
Prin analiza vizual a profilurilor plasmatice, dup cum era de ateptat, se
observa concentraii de diclofenac mai mari n cazul co-administrrii de suc de
grapefruit. Totui, se observ o mare variabilitate n cadrul probelor prelevate la
aceiai timpi dar de la obolani diferii (Figurile III.12-III.16); valorile parametrilor
farmacocinetici (arie de sub curb, T max, C max scot n eviden tendina de
cretere a concentraiilor plasmatice ale diclofenacului administrat simultan cu
sucul de grapefruit. Acest lucru se poate explica att prin farmacocinetica
diclofenacului, caracterizat de variabilitate inter-individuala mare, dar i de
specificul experimentului clinic administrare/ sacrificare animal la un anumit
interval de timp, ceea ce induce un plus de variabilitate.
Pornind de la concentraiile plasmatice ale diclofenacului, s-a realizat
analiza farmacocinetic non-compartimental.
Principalii parametri farmacocinetici determinai au fost:
concentraia maxima plasmatic (Cmax),
timpul de atingere al acesteia (Tmax),
aria de sub curba concentraiilor plasmatice n funcie de timp
(ASC).
timpul de njmtaire (t)
timpul mediu de reziden n organism (TMR).
Primii doi parametri dau indicaii asupra vitezei de absorbie, iar ASC
despre marimea absorbiei. De asemenea, au fost calculai i parametri
farmacocinetici precum timpul de injmatire (t) i timpul mediu de rezidena
n organism (TMR).
20
Analiza farmacocinetic s-a realizat cu ajutorul unui program de

calculator special conceput pentru acest lucru programul Kinetica
(TermoLabSystems, SUA). Rezultatele calculelor farmacocinetice sunt
prezentate detaliat n Anexa I: Detalierea calculelor farmacocinetice i
statistice pentru diclofenac.
Parametrii farmacocinetici ai diclofenacului sunt prezentai n Tabelul
III.11, pentru toti subiecii inclui n studiu.
Tabel III.11
Principalii parametri farmacocinetici ai diclofenacului administrat
singur sau in combinaie cu sucul de grapefruit.
Diclofenac
Diclofenac + suc de
Parametrul
singur
grapefruit
Cmax (ng/ml)
1384.56
2262.59
Tmax (ore)
3
2
ASClast (ng/ml*ora)
7101.78
9233.88
ASCtot (ng/ml*ora)
%ASCextra
t1/2
timp mediu de rezidenta (ore)
7652.13
7.19
2.33
4.35
9527.67
3.08
2.35
3.91
Analizand rezultatele analizei farmacocinetice efectuate, se poate

observa c:
Diclofenacul are concentraii plasmatice la obolan considerabil mai mari n
cazul co-administrrii de suc de grapefruit dect administrat singur. Deoarece
doza administrate (raportat la kg masa corporal) a fost acceai, aceast
observaie dovedete existena interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac
i sucul de grapefruit.
Dintre parametrii farmacocinetici calculate ai diclofenacului, Cmax creste de
la 1384.5 ng/ml (diclofenac administrat singur) la 2262.6 ng/ml
(diclofenac+suc de grapefruit). Aceste valori corespund la o biodisponibilitate
relativ de 163.4%, sau altfel spus concentraiile diclofenacului coadministrat
cu suc de grapefruit cresc cu 63.4% fa de normal, din cauza interaciunii
farmacocinetice. Deoarece creterea Cmax poate fi corelat att cu creterea
cantitaii substanei absorbite, ct i cu viteaza de absorbie, utiliznd doar
valorile Cmax nu se poate preciza mecanismul/locul de interaciune
farmacocinetic.
Un alt parametru farmacocinetic care se modific este aria de sub curba, ce
crete de la 7652.1 ng/ml*ora la 9527.7 ng/ml*ora. Aria de sub curba este un
21
parametru ce se coreleaz cu cantitatea de substan ce ajunge n circulaia

sistemic. Biodisponibilitatea relativ a diclofenacului administrat cu sucul de
grapefruit fa de diclofenacul singur este egal cu 124.5%. Cu alte cuvinte,
n cazul administrrii cu suc de grapefruit, n circulaia sistemic va ajunge cu
24.5% mai mult diclofenac dect dac acesta este administrat singur.
Cresterea ariei de sub curb n cazul coadministrrii diclofenacului cu sucul
de grapefruit constituie i n acest caz o dovad a interaciunii
farmacocinetice.
Exist parametri farmacocinetici ai diclofenacului a cror variaie nu este
marcant ntre cele dou tratamente. Este vorba de timpul de injumtire, cu
valori similare, timpul mediu de reziden i Tmax. Dei diferena ntre Tmax
este de la 3 ore (diclofenac singur) la 2 ore (diclofenac + suc de grapefruit),
diferena nu e relevant datorit valorilor discrete ale parametrului Tmax
(ntre 2 si 3 ore nu poate lua alt valoare deoarece nu au existat prelavari). In
astfel de situaii, diferenele observate nu se considera semnificative.
Faptul c timpii de njumtii ai diclofenacului sunt similari indiferent de
modul de administrare (singur sau cu suc de grapefruit), dovedete faptul c nu
exist o interaciune la nivelul eliminrii substanei; deci sucul de grapefruit nu
infleneaz capacitatea organismului de a elimina aceasta substan.
Din moment ce funcia de eliminare a diclofenacului nu este afectat de sucul
de grapefruit, dar totui parametrii Cmax si ASC dovedesc existenta
interaciunii, aceasta se poate explica doar prin creterea biodisponibilitii
datorit scderii efectului primului pasaj intestinal sau hepatic, fie prin
inhibiia directa a izoenzimei CYP2A4 (ce exist n proporie de 40% n
intestin), fie prin inhibiia glicoproteinei P, cu rol de pompa ce scoate
substana medicamentoas din celula intestinal, impiedicnd sau diminund
absorbia acesteia.
Rezultatele acestui studiu experimental sunt n deplin concordan cu
cele publicate de Mahgoub (2002). Asocierea sucului de grapefruit cu
diclofenacul (doze de diclofenac de 1,0; 2,5; 5,0 mg/kg corp administrate la
obolan concomitent cu sucul de grapefruit), reduce volumul edemului labei
indus cu carageenan n proporie de 19 47%, datorit creterii
biodisponibilitii medicamentului.
De asemenea, rezultatele noaste confirm implicarea sucului de
grapefruit n modularea activitii enzimatice a complexului CYP, izoforma
CYP3A4. Mecanismul prin care pare a fi inactivat enzima CYP3A4 este
descris de mai muli autori. Astfel, Masubuchi et al., (2001) a demonstrat c
incubarea diclofenacului cu microzomi hepatici umani n prezena NADPH a
condus la scderea activitii 6-hidroxilare a testosteronului. Aceast reducere
a activitii i a timpului de reacie, evaluat prin urmrirea cineticii
dependent de concentraie, presupune metabolizare oxidativ, rezistena la
22
reducerea glutationului, sugernd c diclofenacul provoac o inactivare de tip

inhibiie-sinucidere a CYP3A4.
Mecanismul de inactivare de tip inhibiie sinucidere a citocromului
P450 poate deveni o problem clinic grav, pentru c este posibil acumularea
nedorit a medicamentului i producerea interaciunilor medicamentoase. n
cercetarea mecanismului de producere a interaciunilor studierea inhibiieisinucidere este valoroas pentru identificarea unor izoenzime P450
responsabile de reactivitatea unor monooxigenaze specifice i a mai marii lor
selectiviti dect a inhibitorilor competitivi. Proprietatea acestor compui de a
se lega covalent specific de anumii aminoacizi ai P450 specific permite
identificarea site-ul activ al enzimei P450 (Halpert, 1995; Kent et al., 2001).
Aceiai autori (Masubuchi et al., 2001) au semnalat c diclofenacul,
medicament antiinflamator nesteroidian este un inactivator puternic prin
mecanism inhibiie-sinucidere a CYP2C11, izoenzim P450 predominant n
ficatul de obolan de sex masculin; CYP2C11 este enzima responsabil de
metabolizarea major a diclofenacului prin 4-hidroxilare i 5-hidroxilarea (Fig.
III.1), n microzomii hepatici de obolan (Masubuchi et al., 2001). Anterior, ali
autori au demonstrat c alte dou izoenzime P450 distincte, CYP2C9 i CYP3A4
sunt implicate metaboliuzarea diclofenacului, prin hidroxilare n microzomii
hepatici umani (Leemann et al., 1993; Shen et al., 1999; Tang et al., 1999b).
Deoarece CYP2C9 nu a fost inactivat n timpul metabolizrii
diclofenacului (Masubuchi et al., 2001), autorii au sugerat c inactivarea CYP2C11
a fost independent de 4 - hidroxilare, presupunnd c, dimpotriv 5-hidroxilarea
este implicat n inactivarea CYP2C11. Astfel, la om, este posibil ca CYP3A4,
izoenzim major responsabil de 5-hidroxilarea diclofenacului s fie susceptibil
de inactivare n timpul metabolizrii diclofenacului. Un alt metabolit al 5-hidroxidiclofenacului, benzoquinon imina este chimic reactiv i se poate lega covalent de
proteinele celulare (Shen et al., 1999; Tang et al., 1999; Yan et al., 2005).
III.3.6. Concluzii
Finalizarea cercetrilor proprii privind producerea interaciunii
farmacocinetice la administrarea diclofenacului simultan cu sucul de grapefruit a
condus la concluzii care confirm aceast ipotez. Rezultatele obinute, n
concordan cu datele existente n literatura de specialitate, sugereaz inhibiia
tip sinucidere ca mecanim probabil i posibil al producerii interaciunii. Aceste
concluzii sunt susinute de parametrii farmacocinetici ai diclofenacul administrat
concomitent cu sucul de grapefruit, comparativ cu ai medicamentului ca atare.
9 Parcurgerea etapelor de lucru conform protocolului de validare a metodei
HPLC de determinare a diclofenacului a condus la stabilirea condiiilor
cromatografice HPLC care confirm validitatea determinrii:
Instrument : HPLC Agilent Technologies 1100 Series
23
9
9
Coloana : Zorbax SB-C18 100x3.0 mm, 3.5 m

Faza mobila: 52% acetonitril, 48% solutie acid acetic 0.2% (V
Debit: 1 ml/min
Volum injectare: 5 microL
Temperatura coloanei: 40 C
Detectia: MS/MS/MS
Diclofenac: ESI+, EIC(215+248+250) din (278+280) din (296+298),
Timp de retentie: 1.9 minute
Timp de analiza / proba: 2.4 minute
Metoda validat a fost aplicat cu rezultate satisfctoare n etapa
farmacocinetic a studiului.
Stabilirea modelului experimental i aplicarea acestuia la studiul
interaciunii sucului de grapefruit cu diclofenacul, administrat n doz unic
(10 mg/kgc), la obolan a confirmat ipoteza producerii interaciunii
farmacocinetice la asocierea alimentului cu medicamentul luat n studiu.
Biodisponibilitatea relativ a diclofenacului administrat cu sucul de
grapefruit fa de diclofenacul singur este egal cu 124.5%. Cu alte cuvinte,
n cazul administrrii cu suc de grapefruit, n circulaia sistemic va ajunge
cu 24.5% mai mult diclofenac dect dac acesta este administrat singur.
Faptul c timpii de injumatarite ai diclofenacului sunt similari indiferent de
modul de administrare (singur sau cu suc de grapefruit), dovedete faptul c nu
exist o interaciune la nivelul eliminrii substanei; deci sucul de grapefruit nu
infleneaz capacitatea organismului de a elimina aceasta substan.
Din moment ce funcia de eliminare a diclofenacului nu este afectat de
sucul de grapefruit, dar totui parametrii Cmax si ASC dovedesc existena
interaciunii, aceasta se poate explica doar prin creterea biodisponibilitaii
datorit scderii efectului primului pasaj intestinal sau hepatic, fie prin
inhibiia direct a izoenzimei CYP2A4 (ce exist n proporie de 40% n
intestin), fie prin inhibiia glicoproteinei P, cu rol de pompa ce scoate
substana medicamentoas din celula intestinal, impiedicnd sau
diminund absorbia acesteia.
Compararea rezultatelor proprii cu cele ale altor autori permite adugarea
unui nou argument care pledeaz pentru concluzia final: diclofenacul este
recunoscut ca un inhibitor al CYP3A4 prin mecanism inhibiie sinucidere;
5-hidroxi-diclofenacul nu reprezint molecula responsabil de inactivarea
enzimei, dar formarea acestui prim metabolit este esenial pentru inhibarea
enzimei metabolizante. Aceast concluzie deschide o nou perspectiv
asupra consecinelor clinice ale asocierii diclofenacului cu consumul de suc
de grapefruit, care prin unele dintre componentele sale inhib izoenzima
CYP3A4, probabil prin mecanism inhibiie-sinucidere.
24
Capitolul IV
FLAVONOIDELE COMPONENTE BIOACTIVE DIN SUCURI DE
FRUCTE
Obiective
Determinarea flavonoidelor totale din sucuri de fructe.
Standardizarea metodelor HPLC de determinare a naringinei i
naringeninei din sucurile de fructe.
IV.6. DETERMINAREA FLAVONOIDELOR TOTALE DIN
SUCURI DE FRUCTE
Cercetrile experimentale prezentate n acest capitol au ca obiectiv
studiul comparativ al coninutului total n flavonoide, respectiv n naringin
pentru diferite sucuri de fructe: citrice (grapefruit alb, roz i rou, portocale,
mandarine), mere, pere - preparate industrial sau n laborator.
Material i metode
Probe de analizat
Probele supuse analizei (tabel I) au fost sucuri de grapefruit (alb, roz i
rou), de portocale, de mandarine, de pere i de mere - preparate industrial (din
comer) sau n laborator, utiliznd storctorul de fructe. Sucurile de citrice
preparate n momentul utilizrii (n laborator) s-au realizat n trei variante: suc
din pulpa fructului (I), din pulpa fructului i albena (II) i din fructul integral
(III). Sucurile preparate industrial au fost achiziionate din reeaua comercial a
oraului Iai.
Studiu cromatografic
Identificarea flavonoidelor din sucurile de fructe s-a realizat prin
cromatografie pe strat subire pe suport de silicagel, n sistem ascendent (metoda
standardului extern). Ca substane de referin s-au utilizat rutozidul i naringina.
Determinarea cantitativ a flavonoidelor
Determinarea coninutul total n flavonoide exprimat n naringin s-a
realizat prin tehnica prezentat n Farmacopeea Romn, Ediia a X-a,
monografia Cynarae folium (Farmacopeea Romn, 1993).
Calculul coninutului n flavonoide al probelor de suc, exprimat n mg
naringin/100 mL s-a realizat cu ajutorul curbei de calibrare trasate n
prealabil, pentru domeniul de concentraii 0-50g. Separarea flavonoidelor din
probele de sucuri de fructe n vederea determinrii spectrofotometrice s-a
realizat prin tratare cu metanol anhidru (1:1, v/v) i centrifugare timp de 15
25
minute la 3000 RTM. Cot parte din lichidul supernatant a fost prelucrat n
modul indicat la trasarea curbei de etalonare.
IV.7. DETERMINAREA HPLC A NARINGINEI I
NARINGENINEI DIN SUCURI DE FRUCTE
IV.7.1. Metoda de analiz
Pentru analiza naringinei si naringeninei din extracte de fructe s-a
folosit cromatografia de lichide de nalta performanta cuplata cu spectrometria
de masa (LC/MS).
IV.7.1.1. Standarde
Au fost utilizate standarde de naringina (producator Extrasynthese,
Genay, Franta) si naringenina (producator Extrasynthese).
IV.7.1.2.Conditiile de lucru HPLC
Coloana analitica : Kinetex C18, 50 mm x 2.1 mm i.d., 2.6m
Filtru online 0.5 m
Faza mobila:
- Analiza naringenina: amestec acetonitril: solutie acetat de
amoniu 2 mM (V/V), elutie 30 /70
- Analiza naringina: amestec acetonitril: solutie acetat de
Debitul: 0.3 ml/min, temperatura: 40 C
Detectia:
- Naringenina si naringina: ESI-MS, ionizare negativa
Volumul de injectare: 2 l
IV.7.1.3.Conditiile de lucru MS
Sursa de ioni: ESI (electrospray)
Mod ionizare: negativ
Nebulizator: azot, presiune 40 psi
Gaz de uscare: azot, debit 10 L/min, temperatura 350C
Potential capilara: + 3000 V
Mod analiza:
Naringin - MS (m/z 579.1) si
Naringenina - MS/MS (m/z 271> m/z 151.7)
IV.7.2. Analiza naringeninei
Spectrul de masa al unei solutii standard de naringenina este prezentat
in Fig. IV. 33- IV.35. Se observa ionul pseudo-molecular cu m/z 271, obtinut
in urma ionizarii prin deprotonare a naringeninei (M=272). Dupa izolare si
26
fragmentare, ionul pesudo-molecular al naringeninei se scindeaza in ionii cu

m/z 151.7 si 177.7, primul dintre acestia fiind ales mai departe pentru
cuantificare.
Intens.
x10 5
-MS, 0.3-0.3min, 100%=82919

271.3
0.8
0.6
0.4
0.2
114.0
169.8
255.7
213.6 227.8
0 05
297.2
Fig. IV. 33. Spectrele de masa ale naringeninei, obtinute prin ionizare
electrospray, mod negativ: spectru full-scan;
0.0
x10 5
1.5
-MS2(271.1), 0.4-0.4min, 100%=128262

271.1
1.0
0.5
0.04
electrospray, mod negativ: izolare;
0.0
x10 4
-MS2(271.1), 0.6min, 100%=46824

271.1
5
151.7
4
3
2
1
177.6
120.0
0
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
m/z
electrospray, mod negativ: fragmentare
Cromatograma unei solutii standard de naringenina, obtinuta in
conditiile descrise mai sus este prezentata in Fig. IV. 36.
27

Intens.
x10 4
8
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
T i me [mi n]
Fig. IV. 36. Cromatograma unei solutii standard cu naringenina (timp de

retentie analit: 1.65 minute)
Curba de calibrare pentru naringenina (Tabel IV. 4; Fig. IV.37 a fost
realizat in intervalul 50-2500 ng/ml.
Fig. IV. 37. Curba de calibrare pentru determinarea naringeninei

IV.7.3. Analiza HPLC a naringinei
Spectrul de masa al unei solutii standard de naringina este prezentat in
Fig. IV. 39 - Fig. IV. 41. Se observa ionul pseudo-molecular cu m/z 579, obtinut in
urma ionizarii prin deprotonare a naringinei (M=580). Dupa izolare si fragmentare,
ionul pesudo-molecular al naringinei se scindeaza in ionii cu m/z 271.1 si 458.9.
Desi in cazul analizei pe baza unui ion din spectrul MS al unei substante (in cazul
de fata m/z 458.9), sensibilitatea si specificitatea analizei este mult crescuta, in
28
cazul de fata, deoarece randamentul de fragmentare m/z 579 > m/z 459 este mic,
analiza s-a realizat prin monitorizarea ionului pseudomolecular m/z 579, fara
fragmentare ulterioara. Ionul cu m/z 271 din spectrul MS/MS al naringinei
corespunde naringeninei care se obtine in urma ruperii legaturii chimice dintre
aglicon si zaharid.
Intens.
x10 4
4
-MS, 0.1-0.2min, 100%=40267

579.1
3
2
1
0
4
271.2
153.7
325.1
633.4
471.3
Fig. IV. 39. Spectrele de masa ale naringinei, obtinute prin ionizare
electrospray, mod negativ: spectru full-scan;
0
x10 4
-MS2(579.1), 0.3-0.4min, 100%=59855

579.1
6
4
2
0
MS2(579 1) 0 5 0 6 i
100% 6414
electrospray, mod negativ: izolare
0
8000
-MS2(579.1), 0.5-0.6min, 100%=6414

458.9
6000
271.1
4000
579.0
2000
235.2
193.4
0
100
200
313.0
396.9
300
400
500
600
m/z
electrospray, mod negativ: fragmentare
Cromatograma unei solutii standard de naringina, obtinuta in conditiile
descrise mai sus este prezentata in Fig. IV. 42.
29

Intens.
x10 5
1.5
1.0
0.5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Time [min]
EIC 578.8-579.8 -MS2(579.1)
Fig. IV. 42. Cromatograma unei solutii standard cu naringina (timp de

retentie analit: 1.25 minute)
Curba de calibrare pentru naringina (Fig. IV. 43; Tabel IV. 5) a fost
realizata in intervalul 63-6300 ng/ml.
Pentru constructia curbelor de calibrare s-a utilizat modelul quadratic
(y=ax2+bx+c).
Fig. IV. 43. Curba de calibrare pentru naringin

30
Probele de analizat au fost diluate 1/100 cu apa distilata, au fost

centrifugate (3 minute la 12000 rpm) iar 2 l din supernatant s-au injectat in
sistemul cromatografic.
Cromatogramele probelor analizate sunt prezentate in Fig. IV. 51 Fig. IV. 52.
Intens.
x10 5
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Time [min]
Fig. IV. 51. Cromatograma naringinei, Proba 1 Timp retentie: 1.25 minute.
Concentratia de naringina gasita (dupa aplicarea factorului de dilutie) a fost
de 225.3 g/ml
Intens.
x10 5
1.5
1.0
0.5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Time [min]
Fig. IV. 53. Cromatograma naringinei, prob de suc de mere

In aceast prob nu s-a identificat prezena naringinei.
31
Observaie
In cromatogramele naringinei, la timpul de retentie de 1.05 minute se
observa existenta unui alt semnal. Deoarece analiza se face prin spectrometrie
de masa, prezenta acestui semnal de la 1.05 minute denota existenta unui
compus cu aceeasi masa moleculara cu a naringinei (compus izobar).
Pentru a elucida daca acest compus este la randul sau un derivat de
naringenina, a fost realizat spectrul de masa tip MS3 al su, comparativ cu cel
al naringinei.
Cromatograma tip Auto MS3 pentru compusul necunoscut (timp
retentie 1.05 minute) si pentru naringina (timp retentie 1.25 min) este
prezentata in Fig. IV. 54.
Intens.
x10 7
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Time [min]
Fig. IV. 54. Cromatograma tip Auto MS3 pentru compusul necunoscut (RT
1.05 min) si naringina (1.25 min).
Spectrele de masa tip MS3 atat pentru compusul necunoscut, cat si
pentru naringina sunt prezentate comparativ in Fig. IV. 55 - Fig. IV. 57,
respectiv n Fig. IV. 58 - Fig. IV.60.
Se observa ca, spre deosebire de naringina care s-a scindat in doi ioni
principali (cu m/z 271 si 459), compusul necunoscut se scindeaza doar in ionul cu
m/z 271, care este in fapt naringenina, agliconul constitutiv deprotonat. Mai mult,
prin realizarea spectrului MS3 al ionului cu m/z 271 din compusul necunoscut se
observa ionii caracteristici naringeninei (m/z 151.6 si 177.6), ioni care au fost
observati prin analiza spectral directa a acestei substante (Fig. IV. 33).
32
n concluzie, substanta necunoscuta contine ca aglicon naringenina,

dar partea glucidica e diferita de cea din naringina. Datorita componentei sale
(aglicon de naringenina), dupa hidroliza intestinala, si acest compus poate fi
responsabil de inhibitia enzimatica observata la adminsitrarea sucului de
grapefruit.
Intens.
x10 7
0.8
-MS, 1.1min, 100%=7333777

579.6
0.6
0.4
0.2
615.3
00
6
Fig. IV. 55. Spectrele de masa tip MS3-1 pentru compusul necunoscut, timp
retentie 1.05 minute
0.0
x10 6
-MS2(579.6), 1.1min, 100%=709261

271.2
0.8
0.6
0.4
0.2
0.05
S (
0.0
x10 5
-MS3(579.6->271.3), 1.1min, 100%=144991

151.6
1.5
1.0
0.5
108.0
0.0
100
177.6
200
271.1
300
400
500
600
m/z
33

Intens.
x10 7
-MS, 1.2min, 100%=12400246

579.9
1.0
0.5
693.2
615.5
0.0
10 5
MS2(579 7) 1 3 i 100% 515695
Fig. IV. 58. Spectrele de masa tip MS3-1 pentru naringina, timp retentie 1.25
minute
0.0
x10 5
6
-MS2(579.7), 1.3min, 100%=515695

459.1
271.4
2
235.7
313.1
357.0
0
4
S (
Fig. IV. 59. Spectrele de masa tip MS-3-2 pentru naringina, timp retentie
1.25 minute
0
x10 4
-MS3(579.7->459.2), 1.3min, 100%=39464

356.9
235.2
151.6
2
271.1
423.2
0
100
200
300
400
500
600
m/z
Fig. IV. 60. Spectrele de masa tip MS3-3 pentru naringina, timp retentie 1.25
minute
IV.7.3.1. Determinarea naringinei din probe de sucuri
Probele supuse analizei au fost sucuri de grapefruit (alb, roz i rou), de
portocale, de mandarine, de pere i de mere - preparate industrial (din comer)
sau n laborator, utiliznd storctorul de fructe. Sucurile de citrice preparate n
momentul utilizrii (n laborator) s-au realizat n trei variante: suc din pulpa
34
fructului (I), din pulpa fructului i albena (II) i din fructul integral (III). Sucurile
preparate industrial au fost achiziionate din reeaua comercial a oraului Iai.
Pentru analiza HPLC, probele de suc preparate anterior sau procurate
din reeaua comercial au fost diluate 1/100 cu apa distilata, au fost
centrifugate (3 minute la 12000 rpm), iar 2 l din supernatant s-au injectat in
sistemul cromatografic.
In nici una din probele analizate nu a fost identificata naringenina.
Acest lucru este explicabil prin faptul ca naringenina (agliconul aflat in
structura naringinei) nu se gaseste liber ca atare n produsul alimentar, ci apare
in organism doar dupa hidroliza enzimatica a naringinei in timpul absorbtiei.
IV.7.3.1.1. Rezultate
Concentratiile de naringina determinate in probele analizate sunt
prezentate in figurile IV. 77 IV. 79.
Fig. IV. 77. Concentraiile naringinei n probele de suc de grapefruit

preparate n laborator
35
Fig. IV. 78. Concentraiile naringinei n probele de suc de citrice (pomelo,

mandarine, portocale)
Fig. IV. 79. Concentraiile naringinei n probele de suc de grapefruit

preparate industrial
36
Fig. IV. 80. Concentraiile naringinei n probele de sucuri de fructe

preparate industrial
IV.7.3.1. 2. Discuii
Din analiza concentraiilor naringinei n sucurile de grapefruit
preparate n laborator se constat valori mai crescute la sucul preparat din
grapefruit rou-fructul integral (292,24 mg/100 mL i valori mai sczute, dar
apropiate la sucul preparat din grapefruitul alb, respectiv roz. Aceleai
constatri sunt valabile pentru sucurile preparate din pulpa fructului. Pentru
acest produs, concentraiile de naringin variaz de la 225,32 mg/100 mL la
grapefruitul rou, la 186,06 mg/100 mL pentru sucul din grapefruit alb.
Sucurile de portocale au concentraii de naringin mult mai sczute: 67,41
mg/100 mL la sucul preparat din pulpa fructului, 86,37 mg/100 mL pentru sucul
preparat din fructul integral i 94,12 mg/100mL pentru sucul preparat din pulpa i
albena. n sucul de mandarine s-au determinat concentraii de naringin cuprine
ntre 81,65 mg/100 mL i 116,23 mg/100 mL. Pentru pomelo concentraiile de
naringin sunt semnificativ mai crescute; astfel, sucul de pomelo preparat din pulpa
fructului conine 2024 mg naringin/100 mL, sucul obinut din pulpa i albena are
1496,58 mg/100 mL, n timp ce produsul obinut din fructul integral are 1424, 21
mg/100 mL.
n ceea ce privete coninutul n naringin a buturilor rcoritoare
preparate industrial pe baz de suc de grapefruit, variabilitatea concentraiilor
este cu mult mai mare, n funcie de proporia de suc utilizat la preparare. La
unele sortimente (proba 13) n-a fost evideniat prezena naringinei, pe cnd la
altele (proba 9) valorile coninutului de naringin au urcat la 420,96 mg/100 mL.
37
Rezultate obinute de noi sunt n concordan cu unele date din

literatura de specialitate. Astfel, Ross et al. (2000) au raportat concentraii de
flavonoide totale care variaz ntre 19,44 i 84,28 mg/100 mL pentru 9 probe
de suc de grapefruit preparat industrial. Naringina, flavonoidul major
determinat n aceleai sucuri are concentraii cuprinse ntre 14,56 i 63,80 mg/
100 mL. Ribeiro et al. (2008) au determinat naringina prin HPLC cu detecie
PAD (photodiode array detector); coninutul mediu n naringin variaz ntre
36,6 mg/100 mL i 134,7 mg/100 mL suc. Autorii au remarcat absena
naringeninei din probele analizate; rezultatele sunt n concordan cu cele
obinute de noi.
IV. 8. CONCLUZII
Flavonoidele reprezint o clas important de componente bioactive din
fructe, n general i din fructele citrice, n special. Flavonoidele prezente n partea
comestibil a fructului de grapefruit sunt considerate parial responsabile de
interaciunile cu diferite principii active medicamentoase. Pn n prezent au fost
identificate: naringina, poncerina, narirutin, neohesperidina, hesperidina, didymina,
narirutin-4-glucozida, naringin-4-glucozida, naringin-6-malonat, eriocitrina,
neoeriocitrina, rhoifolin, isorhoifolin, diosmina. Speciile de grapefruit difer ntre
ele n ceea ce privete coninutul n flavonoide. Principalele flavonoide prezente
sunt: naringina, hesperidina, neohesperidina, neoeriocitrina.
9 Determinarea HPLC a coninutului n naringin s-a realizat dup
standardizarea condiiilor de lucru:
Conditii de lucru HPLC
Coloana analitica : Kinetex C18, 50 mm x 2.1 mm i.d., 2.6 m
Filtru online: 0.5 m
Faza mobila:
- Analiza naringenina: amestec acetonitril: solutie acetat de
- Analiza naringina: amestec acetonitril: solutie acetat de
Debitul: 0.3 ml/min, temperatura: 40 C
Detectia:
- Naringenina si naringina: ESI-MS, ionizare negativa
Volumul de injectare: 2 l
Condiii de lucru MS
Sursa de ioni: ESI (electrospray)
Mod ionizare: negativ
Nebulizator: azot, presiune 40 psi
Gaz de uscare: azot, debit 10 L/min, temperatura 350C
Potential capilara: + 3000 V
38
Mod analiza:
Naringin - MS (m/z 579.1) si
Naringenina - MS/MS (m/z 271> m/z 151.7)
9 Cercetrile experimentale prezentate n acest capitol au urmrit
determinarea coninutului n flavonoide totale, tiut fiind faptul c aciunea
benefic asupra organismului este datorat, n general fitocomplexului i nu
unui anumit component izolat n stare pur din acesta. Valorile obinute la
determinarea flavonoidelor totale din cele 25 de probe de sucuri (preparate
n laborator sau achiziionate din reeaua comercial), cuprinse ntre 18,32
i 102,54 mg/100mL, evideniaz o mare variabilitate n funcie de natura
produsului i de metoda de preparare a sucului.
9 Determinarea coninutului n flavonoide totale n sucuri de fructe (citrice,
mere, pere) preparate industrial sau n laborator a evideniat valori diferite
att n funcie de natura fructului ct i dup modul de preparare al sucului.
Sucul preparat din fructul integral este mai bogat n flavonoide, respectiv n
naringin, comparativ cu sucul preparat din pulpa fructului.
9 Sucurile preparate industrial, din fruct integral prezint valori ale
coninutului n flavonoide apropiate de cele preparate n laborator.
Diferenele constatate ntre concentraiile n componentele bioactive ale
sucurilor de fructe explica intensitatea diferit a interaciunilor
farmacocinetice care se manifest la administrarea simultan cu
medicamente din clase terapeutice diferite.
Capitolul V
FURANOCUMARINELE - SUBSTANE BIOACTIVE DIN
SUCUL DE GRAPEFRUIT
V.3. DETERMINAREA BERGAMOTINEI DIN SUCURI DE
FRUCTE
Obiectivele cercetrii
Dup ce au fost prezentate rezultatele cercetrilor proprii care au
confirmat producerea interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de
grapefruit a fost necesar iniierea cercetrilor privind evidenierea componentelor
bioactive din suc, responsabile de producerea interaciunii - flavonoidele totale i
naringina - reprezentantul major al acestei clase de compui. Datele din literatura
de specialitate demonstreaz rolul predominant al furanocumarinelor n producerea
interaciunii sucului de grapefruit cu diferite medicamente.
Determinarea cantitativ a furanocumarinelor din probe de sucuri de
diferite proveniene ar putea explica variaiile mari ale intensitii
interaciunilor produse, in funcie de coninutul de furanocumarine al sucului
administrat. n acest capitol prezentm rezultatele unui studiu prin care s-a
39
realizat separarea, identificarea i determinarea cantitativ a bergamotinei din

sucuri de fructe (grapefruit, portocale, mandarine, mere, pere).
V.3.1. Material i metode
Probe de analizat
Fructele din care s-au preparat sucurile (grapefruit, portocale, mandarine,
pere, mere) au fost achizitionate din reteaua comerciala a orasului Iai. Sucurile au
fost preparate n laborator din fructul integral, respectiv din pulpa fructului, cu
ajutorul storcatorului de fructe.
n timpul depozitrii sucurile de fructe separ dou frac iuni: un
supernatant i precipitatul corespunztor. n literatura de specialitate este semnalat
concentraia diferit a bergamotinei n cele dou fraciuni (Girennavar et al., 2006).
Determinarea concentraiilor bergamotinei s-a realizat prin metoda HPLC
dezvoltat de no pentru fiecare dintre cele dou fraciuni obinute din sucul integral
de grapefruit rou, alb, respectiv roz. Separarea celor dou fraciuni s-a realizat prin
centrifugarea sucului la 10.000 rpm, timp de 20 de minute.
Pentru analiza HPLC a sucului integral, acesta a fost diluat (1:1) cu
metanol, meninut 30 de minute la temperatura camerei i centrifugat la 3000
rpm timp de 15 minute. Lichidul supernatant se injecteaza n sistemul
cromatografic.
Reactivi
Silicagel pentru cromatografia pe coloana, 230-400 mesh (Chemical
Company Inc).
Solveni de puritate analitic (Fluka) pentru extractia i eluarea
bergamotinei.
Solveni pentru analiza HPLC (Cromasolv Company).
Standard bergamottin, Sigma Aldrich, lot BCBC-0571.
V.3.1.1. Extracia bergamotinei
1200 mL suc de grapefruit rou diluat cu 1200 mL ap distilat se
extrag de trei ori succesiv cu acetat de etil (1:1). Fazele organice reunite se
evapora la sec (evaporator Buchi); se obine reziduul brut (1,3 g).
V.3.1.2. Separarea bergamotinei prin cromatografie pe coloan (CC)
Reziduul (1,3 g) s-a amestecat cu 1,3 silicagel i s-a adus ntr-o coloan
cromatografic 250/3 cm coninnd silicagel pentru CC umectat cu hexan. Eluarea
componentelor extractului brut s-a realizat succesiv cu fraciuni a 50 mL de: hexan;
hexan-acetat de etil (90:10); (85:15); (80:20); (70:30); (60:40); (40:60); (20:80);
(10:90) i (0:100). Cele 10 fraciuni colectate au fost evaporate la sec i supuse
analizei TLC, respectiv HPLC.
40
V.3.1.3. Identificarea bergamotinei prin cromatografie pe strat

subire (CSS)
Pentru analiza TLC s-au utilizat placile Fertigplaten Kieselgel g
Merck, 20/20cm. Reziduul fiecarei fractiuni, dizolvat in 0,5 mL metanol a fost
spotat (0,5L) pe linia de start a placii cromatografice alaturi de bergamotina
(standard extern); sistem de solventi hexan acetat de etil (4:1). Bergamotina a
fost vizualizat sub forma unor spoturi albastru nchis, dup pulverizarea pe
plac a soluiei de acid sulfuric 10% i meninerea la 110C timp de 10 minute.
V.3.1.4. Analiza HPLC a bergamotinei
Determinarea cantitativ a bergamotinei din sucurile de fructe ca atare,
respectiv dup separarea prin cromatografie pe coloan (Tabel I) s-a realizat
prin cromatografia de lichide de nalta performanta cuplat cu spectrometria de
mas (LC/MS), adaptat dup metoda utilizat de Girennavar et al (2008).
Aparatur
Sistem HPLC Agilent Technologies 1100 series
Module:
- Spectrometru de masa Agilent Ion Trap 1100 SL;
- Termostat G1316A;
- Autosampler G1329A;
- Pompa binara G1312A;
- Degazor G1379A.
Condiiile de lucru HPLC:
- Coloana analitica: Zorbaz SB-C18 100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 m
(Agilent, SUA);
- Filtru on-line 0.2 microni (Agilent) ;
- Faza mobila: amestec solutie acid acetic 0.1% (V/V) si metanol in
raport 15/85 (v/v) ;
- Debit: 1 ml/min, temperatura: 40 C;
- Detecie: MS/MS fragmentare ion cu m/z 339, corespunztor
moleculei bergamotinei protonate, apoi monitorizare ion cu m/z
203 din spectrul MS/MS al analitului;
- Volum de injectare: 5 l;
- Timp de retentie: 1.75 minute
- Timp total de analiza: 2.2 minute;
Conditiile de lucru MS:
- Sursa de ioni: APCI (atmosferic pressure chemical ionisation);
- Mod ionizare: pozitiv;
- Nebulizator: azot, presiune 60 psi;
- Gaz de uscare: azot, debit 7 L/min, temperatura 350 C;
- Temperatur: 400C; heater
41
- Potential capilara: 3000 V;

- Mod analiza: monitorizare tranzitie m/z 339 > 203.
Cromatograma i spectrul MS al bergamotinei sunt prezentate n fig.
V. 41 i V. 42
Fig. V. 41. Cromatograma MS a bergamotinei
Fig.V.42. Spectrul MS al bergamotinei

42
V.3.1.5.Curba de calibrare a bergamotinei

Curba de calibrare a bergamotinei, detec ie MS/MS (Fig. V. 43 - V.
44, Tabelul V.2) s-a realizat in intervalul de concentratii 26.4-2641 ng/ml.
Fig.V.43. Curba de calibrare a bergamotinei (detectie MS/MS)

Determinarea bergamotinei din probele de sucuri de fructe
Determinarea cantitativ a bergamotinei din sucurile de fructe ca atare,
respectiv dup separarea prin cromatografie pe coloan (TabelV. 1) s-a realizat
prin cromatografia de lichide de nalta performanta cuplata cu spectrometria de
masa (LC/MS).
V.3.2. Rezultate i discuii
Rezultatele obinute la determinarea cantitativ a a bergamotinei din
sucurile de fructe ca atare, respectiv dup separarea prin cromatografie pe
coloan sunt prezentate n figurile V.56 - V.61.
Continutul n bergamotina, exprimat n mg/ 100 mL suc s-a calculat cu
ajutorul curbei de calibrare (Fig. V.43) i este prezentat n figurile V. 62
V.65.
43
Fig. V.62. Coninutul n bergamotin pentru probele de suc de grapefruit.
Fig. V.63. Coninutul n bergamotin al sucurilor de grapefruit separate n

fraciuni
44
Fig. V.64. Coninutul n bergamotin al sucurilor de citrice
Fig. V.65. Coninutul n bergamotin al sucurilor de grapefruit separate n

fraciuni, comparativ cu sucul nefracionat
45
Fig.V. 66. Concentraiile bergamotinei n sucurile de citrice analizate

Coninutul n bergamotin pentru sucurile obinute din fructul integral
de grapefruit (probele 1,4,7) variaz ntre 2,49 mg/100 mL pentru proba 1 i
0,97 pentru proba 7 (fig. 4). Valorile obinute sunt mai mici pentru sucurile
preparate din pulpa fructelor de grapefruit (probele 2, 5, 8, figura 5).
Concentraiile bergamotinei din fraciunile separate prin cromatografia pe
coloan sunt destul apropiate de cele obinute pentru sucul preparat din fructul
integral corespunztor; aceasta sugereaz faptul c separarea componentelor
sucului prin cromatografie pe coloan decurge cu randamente satisfctoare.
Rezultatele sunt n concordan cu concentraiile determinate de ali autori;
astfel, Uno et al. (2006) au raportat valori medii de 1,7 mg bergamotin/250 ml
suc (0,68 mg/100 mL), Uno et al (2006) Paine et al. (2006) 0,33 12,37
mg/100 mL., de Castro (2006) concentraii de 0,67 9,53 mg /100ml, iar
Girennavar et al. (2008) concentraii medii cuprinse ntre 0,038 i 0,128
mg/100ml.
Rezultatele obinute la determinarea bergamotinei din cele dou
fraciuni obinute prin centrifufarea sucului integral sunt consemnate n fig. V.
63. Aceste rezultate sunt n deplin concordan cu valorile obinute de Guo et
al. (2006). Autorii respectivi au continuat cercetrile i au evaluat capacitea de
inhibare a izoenzimei CYP3A4 de ctre fiecare dintre cele dou fraciuni
separate prin centrifugare, activitate corelat cu coninutul n componente
furanocumarinice.
46
De remarcat faptul c toi autorii au semnalat o mare variabilitate a

coninutului sucurilor de grapefruit n bergamotin, explicat prin existena a
numeroase varieti de fruct i metodele diferite de preparare a sucului (De
Castro et al., 2006).
n sucurile de mere, pere, afine i portocale sweet n-a fost
identificat prezena bergamotinei.
V.4. CONCLUZII
Datele publicate n literatura de specialitate n urma realizrii a numeroase
studii clinice n care diferite medicamente au fost asociate cu sucul de grapefruit
au scos n eviden o mare variabilitate n intensitatea interaciunilor provocate.
Aceast variabilitate poate fi pus pe seama compoziiei chimice a sucurilor,
izomorfismului enzimelor implicate n metabolizarea medicamentelor,
particularitilor genomului uman etc.
Coninutul n furanocumarine al sucurilor de citrice este foarte diferit n
funcie de specie, varietate, condiiile specifice de cultur, dar mai ales
modalitilor foarte diverse de preparare a sucului.
n paralel cu studiile privind inhibarea CYP3A4 de ctre sucurile de
grapefruit au fost realizate teste similare pentru sucuri preparate din alte fructe n a
cror compoziie sunt prezente furanocumarinele. Aceste studii simultane au
confirmat rolul componentelor furanocumarinice n producerea interaciunilor
aliment-medicament. Sucul de sweetie, spre exemplu, a manifestat aciune
inhibant asupra CYP3A4 chiar mai intens dect grapefruitul. Aceast aciune
este concordant cu coninutul n furanocumarine, care pentru unele sortimente de
suc de sweetie este de 2-3 ori mai crescut dect cel din grapefruit. n alte situaii,
furanocumarinele n-au putut fi evideniate n sucul de sweetie.
Taxonomic, varietile de citrice obinute prin incruciri ntre grapefruit,
pomelo sau portocale au condus la obinerea unor fructe cu coninut variabil, i nu
ntotdeauna cunoscut de furanocumarine. De altfel, i pentru alte produse vegetale
coninnd ca i componente bioactive furanocumarinele este cunoscut i
recunoscut capacitatea de a produce interaciuni de tipul celor aprute la consumul
sucului de grapefruit simultan cu administrarea unor medicamente. Aceste date
sunt n concordan cu rezultatele cercetrilor noastre care au pus n eviden valori
foarte difetite ale coninutului n bergamotin al sucului, pentru acelai fruct n
funcie de modul de preparare, dar i pentru fructe diferite sweetie, portocale,
mandarine, pomelo).
Pentru nceput s-au standardizat metodele HPLC/MS de determinare a
bergamotinei; performana metodei a permis aplicarea acesteia i la probele cu un
coninut sczut de bergamotin.
47
Determinarea HPLC a bergamotinei din probe de sucuri de fructe (citrice,

mere, pere, afine) a condus la rezultate concordante cu cele publicate n literatura
de specialitate.
Coninutul n bergamotin pentru sucurile preparate din pulpa fructelor de
grapefruit este mai sczut dect pentru cele obinute din fructul integral de
grapefruit.
Concentraiile bergamotinei din fraciunile separate prin cromatografia pe
coloan sunt destul apropiate de cele obinute pentru sucul preparat din fructul
integral corespunztor; aceasta sugereaz faptul c separarea componentelor
sucului prin cromatografie pe coloan decurge cu randamente satisfctoare.
Remarcm o mare variabilitate a coninutului sucurilor de grapefruit n
bergamotin, explicat prin existena a numeroase varieti de fruct i metodele
diferite de preparare a sucului; aceas variabilitate a coninutului n componente
bioactive este corelat cu rezultatele obinute la studiul interaciunii
farmacocinetice a diclofenacului cu diferite sucuri de fructe.
Capitolul VI
STUDIUL COMPARATIV AL INFLUENEI UNOR SUCURI DE
FRUCTE ASUPRA FARMACOCINETICII DICLOFENACULUI, LA
OBOLAN
Protocol experimental
Pentru fiecare suc de fructe s-a aplicat modelul experimental stabilit
anterior. S-a lucrat cu cte dou loturi de obolani Wistar, care au primit:
Lotul I- cte 2 ml ap i, dup 30 de minute 10 mg diclofenac (soluie
apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltarea sngelui (din plexul
orbital) s-a realizat la intervale de 30, 60, 90, 120 minute, 3h, 4h, 6h, 8h, 10 h
i 12 ore de la administrarea medicamentului. Pentru fiecare interval de timp sau recoltat probe de snge de la 5 animale. Sngele a fost centrifugat imediat
dup recoltare, iar plasma a fost pstrat la congelator (-36C) pna la analiza
HPLC/MS, prin metoda de dozare validat anterior.
Lotul II (grepfrut rou) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de
grapefruit rou, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (grapefruit
rou), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10
mg /kg corp.
Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n
Lotul III (grepfrut alb) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de
grapefruit alb, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (grapefruit
alb), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg
/kg corp.
48

Lotul IV (pomelo) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de pomelo,
proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (pomelo), i dup 30 de minute,
diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp.
Lotul V (portocale) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de
portocale, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (portocale
Grecia), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10
mg /kg corp.
Lotul VI (mandarine) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de
mandarine, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (mandarine
Grecia), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10
mg /kg corp.
Lotul VII (afine) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de afine,
proaspt preparat n storctorul electric a fructelor (afine proaspete), i dup 30
de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp.
Lotul VIII (mere) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de mere,
proaspt preparat n storctorul electric a fructelor (mere Golden auriu), i dup
30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp.
Etapa analitica. Rezultate
Pentru dozarea diclofenacului din plasma de sobolan s-a folosit
cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de
masa (HPLC/MS), metoda standardului extern. Metoda a fost validat conform
protocoalelor n vigoare pentru stabilirea condiiilor de aplicare a metodelor
HPLC.
Rezultatele studiului analitic.
Utiliznd metoda HPLC-MS dezvoltat i validat, au fost determinate
concentraiile plasmatice ale diclofenacului din probele clinice. Acestea sunt
redate n Tabelul VI.1
49
Tabel IV.1
Concentraiile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau
asociat cu suc de fructe
Interval de recoltare
(ore)/Tratament
Diclofenac singur
Diclofenac + suc de
grapefruit rosu
Diclofenac + suc de
grapefruit alb
Diclofenac + suc de
pomelo
Diclofenac + suc de
portocale
Diclofenac + suc de
mandarine
Diclofenac + suc de
afine
Diclofenac + suc de
mere
Concentraia diclofenacului (ng/mL)

0,5
1,5
662,6 1018,4 1154,3 1336,9 1384,6 1020,3

797
1393
6
484
1728,5 2262,6 1776,5 1153,7 571,5
10
12
277,3 179,7 137,7

259
133,4 99,5
612,4 1002,5 1685,3 2213,5 1812,4 1020,4 518,6 268,3 182,5 114,5
338,4 1412,3 1995,3 2245,4 1818,2 1153,4 800,2 574,5 212,4 202,5
583,4 1213,5 1218,4 1525,3 1498,2 1095,4 373,2 214,8 105,2
0,0
608,2 1218,4 1305,5 1812,2 1602,8 1105,3 395,2 312,4 205,8 162,3
525,3
989,4 1814,2 2490,5 2204,3 1412,7 437,9 373,8 218,6 182,5
814,3 1340,1 1802,5 2080,4 1892,1 1157,4
582
292,5 137,4 63,2
Etapa farmacocinetic
Profilurile plasmatice suprapuse ale diclofenacului, n funcie de
perioada de recoltaree (cu sau fr sucul de fructe), sunt prezentate n Fig. VI.1
VI. 7 (grafice carteziene), n=5.
Fig. VI.1. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau

asociat cu sucul de grapefruit rou
50
Fig. VI. 2. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau

asociat cu sucul de grapefruit alb
Fig. VI.3.Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau

asociat cu sucul de pomelo
51

asociat cu sucul de portocale

asociat cu sucul de mandarine
52

asociat cu sucul de afine

asociat cu sucul de mere
Pe baza concentraiilor plasmatice al diclofenacului administrat singur
sau n asociere cu sucurile de fructe s-au calculat parametrii farmacocinetici (C
max, Tmax, aria de sub curb), Tabel VI. 2.
53
Tabel VI. 2
Parametrii farmacocinetici ai diclofenacului
Parametrul
Tmax
ASC last
ASC tot
(ore)
(ng/ml*ora) (ng/ml*ora)
Diclofenac/diclofenac i suc de fructe
Cmax
(ng/ml)
Diclofenac singur
1384.56
7101.78
7652.13
Diclofenac + suc de grapefruit rosu
2262.59
9233.88
9527.67
Diclofenac + suc de grapefruit alb
2213,51
9033,58
9320,50
Diclofenac + suc de pomelo
2245,43
9163,85
9455,41
Diclofenac + suc de portocale
1525,37
6225,21
6423,27
Diclofenac + suc de mandarine
1812,29
7396,16
7631,48
Diclofenac + suc de afine
2490,53
10164,13
10487,52
Diclofenac + suc de mere
2080,41
8490,39
8760,52
Discuii
Din analiza datelor farmacocinetice pentru diclofenac, obinute pe
baza acestui studiu experimental s-a constatat:
Cmax creste de la 1384.5 ng/ml (diclofenac administrat singur) la valori
cuprinse ntre 1525,37 ng/mL pentru diclofenacul asociat cu sucul de
portocale i 2490,53 ng/mL pentru sucul de afine. Valoarea concentraiei
plasmatice maxime pentru sucul de grapefruit alb (2213,51) este destul de
apropiat de cea obinut pentru asocierea diclofenacului cu sucul de grape
fruit rou (2262.6 ng/ml). Cele mai mici valori ale C max s-au obinut
pentru sucul de portocale. Aceste valori corespund la o biodisponibilitate
relativ de 163.4% pentru sucul de grapefruit rou, de 159,86 % pentru
grapefruitul alb, de 110,16% pentru sucul de portocale; cea mai mare
valoare pentru biodisponibilitatea relativ s-a obinut pentru sucul de afine,
de 179,86. Aceasta nseamn o cretere a concentraiilor diclofenacului
coadministrat cu sucurile de fructe cu 63.4%, 59,86%, 10,16% i respectiv
79,86% fa de aceleai concentraii de diclofenac administrat singur.
Aria de sub curb, parametru ce se coreleaz cu cantitatea de substan ce
ajunge n circulaia sistemic crete de la 7652,1 ng/ml*or la 9527,7
ng/ml*or pentru sucul de grapefruit rou, la 9320,50 ng/ml*or pentru
sucul de grapefruit alb, la 6423,27 ng/ml*or pentru sucul de portocale i
la 10487,52 ng/ml*or pentru sucul de afine. Cresterea ariei de sub curb n
cazul coadministrrii diclofenacului cu sucrile de fructe constituie o dovad
a producerii interaciunii farmacocinetice.
54
Tmax pentru diclofenacul administrat singur este de 3 ore i a sczut la 2

ore pentru toate loturile la care diclofenacul a fost asociat cu sucurile de
fructe; aceast diferena nu este relevant datorit valorilor discrete ale
parametrului Tmax (ntre 2 si 3 ore nu poate lua alt valoare deoarece nu au
existat prelavari). In astfel de situaii, diferenele observate nu se considera
semnificative.
Rezultatele obinute de noi, n concordan cu cele publicate de
Ushijima et al. (2009 care a studiat efectul ingestiei sucului de afine asupra
farmacocineticii diclofenacului la subieci umani.
Deoarece informaiile cu privire la influena sucului de afine asupra
farmacocineticii substraturile CYP2C9 este limitat, este prematur a ajunge la o
concluzie definitiv cu privire la efectul sucului de afine asupra
farmacocineticii medicamentelor care sunt metabolizate extensiv de CYP2C9.
Pentru a clarifica influena ingestiei repetate a sucului de afine asupra
farmacocineticii diclofenacului, s-a realizat studiul clinic la subieci sntoi
umani. Ingestia timp de cinci zile a sucului de afine nu a influenat semnificativ
concentraia plasmatic a diclofenacului (Fig. VI. 8)
Capitolul VII
CONCLUZII GENERALE
Interaciunile medicamentoase reprezint o surs major de accidente
sau de eecuri terapeutice, mai ales n situaii de polimedicaie. Mecanismele
farmacocinetice care pot induce interaciuni medicamentoase sunt mai dificil de
prevzut de ctre clinicieni dect interaciunile farmacodinamice care pot fi
anticipate pe baza aciunii farmacologice a medicamentelor administrate. Pe
parcursul diferitelor faze ale cineticii medicamentelor, metabolismul i, n
particular, biotransformarile catalizate de citocromii P450 pot conduce la
interaciuni semnificative care se manifest la nivelul absorbiei intestinale sau al
excreiei renale. Majoritatea medicamentelor administrate pe ale oral se absorb,
n principal, n intestinul subire. Alimentele, prezente simultan n tubul digestiv,
pot influena eficacitatea principiilor active medicamentoase prin diminuarea sau,
din contr, intensificarea efectelor terapeutice. Interaciunile privesc, adesea,
absorbia medicamentelor de-a lungul tubului digestiv, dar anumii nutrieni
modific metabolismul i eliminarea medicamentelor. Alimentele pot influena
att viteza de absorbie ct i biodisponibilitatea unui medicament.
Cercetrile experimentale prezentate n partea personal a lucrrii de
doctorat au urmrit aprofundarea cunotinelor privind producerea unei
interaciuni farmacocinetice ntre diclofenac i sucul de grapefruit. Finalizarea
cercetrilor proprii privind producerea interaciunii farmacocinetice la
55
administrarea diclofenacului simultan cu sucul de grapefruit a condus la

concluzii care confirm aceast ipotez.
Rezultatele obinute, n concordan cu datele existente n literatura de
specialitate, sugereaz inhibiia tip sinucidere ca mecanism probabil i posibil
al producerii interaciunii. Aceste concluzii sunt susinute de parametrii
farmacocinetici ai diclofenacul administrat concomitent cu sucul de grapefruit,
comparativ cu ai medicamentului administrat ca atare.
Calcularea parametrilor farmacocinetici s-a realizat pe baza determinrii
HPLC a concentraiilor plasmatice ale diclofenacului. Pentru aceasta:
- am validat metoda HPLC /MS de determinare a diclofenacului;
- am standardizat i am aplicat modelul experimental de studiu al
interaciunii farmacocinetice diclofenac suc de grapefruit;
- am trasat profilurile plasmatice ale diclofenacului n vederea calculrii
parametrilor farmacocinetici;
- am confirmat producerea interaciunii farmacocinetice pe baza creterii
semnificative a biodisponibilitii relative a diclofenacului asociat cu sucul
de grapefruit rou.
Compararea rezultatelor proprii cu cele ale altor autori permite
adugarea unui nou argument care pledeaz pentru concluzia final:
diclofenacul este recunoscut ca un inhibitor al CYP3A4 prin mecanism
inhibiie sinucidere; 5-hidroxi-diclofenacul nu reprezint molecula
responsabil de inactivarea enzimei, dar formarea acestui prim metabolit este
esenial pentru inhibarea enzimei metabolizante. Aceast concluzie deschide o
nou perspectiv asupra consecinelor clinice ale asocierii diclofenacului cu
consumul de suc de grapefruit, care prin unele dintre componentele sale inhib
izoenzima CYP3A4, probabil prin mecanism inhibiie-sinucidere.
Componentele bioactive din sucul de grepfrut, considerate
responsabile de producerea interaciunii sunt flavonoidele i furanocumarinele.
tiut fiind faptul c aciunea benefic asupra organismului este datorat, n
general fitocomplexului i nu unui anumit component izolat n stare pur din
acesta. Am determinat coninutul n flavonoide totale. Valorile obinute la
determinarea flavonoidelor totale din cele 25 de probe de sucuri (preparate n
laborator sau achiziionate din reeaua comercial), cuprinse ntre 18,32 i
102,54 mg/100mL, evideniaz o mare variabilitate n funcie de natura
produsului i de metoda de preparare a sucului.
n paralel am determinat coninutul n naringin, flavonoidul majoritar
al sucurilor din care am determinat coninutul total n flavonoide. Pentru
aceasta am stabilit condiiile HPLC/MS de determinare a naringinei i am
aplicat metoda la analiza probelor de sucuri. Rezultatele obinute sunt
56
concordante cu cele publicate n literatura de specialitate; am confirmat, i de

aceast dat variaii mari ale valorilor naringinei, n funcie de sursa probei de
analizat. Coninutul n naringin nu se coreleaz cu intensitatea interaciunii
farmacocinetice; de fapt naringina este considerat prea puin responsabil de
proodu cerea interaciunii.
Capacitatea bergamotinei de a inactiva izoforme ale complexului
enzimatic CYP450 i implicit rolul acestei furanocumarine n producerea
interaciunii sucului de grapefruit cu medicamentele metabolizate de cele dou
izoenzime este firul rou al carcetrilor actuale prvint frecvena i relevana
clinic a interaciunilor dintre medicamente i sucuri de fructe. n plus, unii
autori au studiat posibilitatea mbogirii unor sucuri de fructe n bergamotin
pentru a confirma rolul bergamotinei n mecanismul de producerii interaciunii.
Cercetrile proprii n domeniul furanocumarinelor au urmrit
determinarea, printr-o metod performant a bergamotinei, furanocumarina
majoritar din sucul de grapefrut.
Pentru aceasta:
- am standardizat metoda HPLC /MS de determinare a bergamotinei;
- am aplicat metoda la determinarea bergamotinei din 25 de probe de sucuri
de fructe;
- ca i n cazul naringinei, rezultatele, concordante cu cele din literatura de
specialitate, relev o mare variabilitate a coninutului n bergamotin.
Concluziile mai multor autori care studiaz rolul sucurilor vegetale n
modularea farmacocineticii medicamentelor par a confirma evidenierea unor
aspecte mai puin elucidate i care ar necesita regndirea importanei acestor
interaciuni.
De aceea, am iniiat un studiu experimental n care am urmrit
influena unor sucuri de fructe (grepfrut rou, grepfrut alb, pomelo, portocale,
mandarine, afine, mere) asupra concentraiior plasmatice ale diclofenacului;
acelai model experimental, stabilit n prima parte a cercetrilor a fost aplicat i
n acest studiu. Ariile de sub curb, calculate pe baza concentraiilor plasmatice
ale diclofenacului au evideniat variaii semnificative ale valorilor
biodisponibilitii relative a diclofenacului.
Ca o concluzie final sucurile de citrice n general i sucul de
grepfrut n special, prin componente bioactive specifice intervin n
biotransformarea medicamentelor la nivelul organismului uman i pot modula
biodisponibilitatea, implicit eficacitatea terapeutic a acestora. Medicul i
farmacistul au datoria de a cunoate aceste interaciuni i de a informa corect
pacientul n privina riscurilor consecutive consumului de suc de citrice
simultan cu aministrarea de medicamente.
57
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Ameer B, Weintraub RA, Johnson JV, Yost RA, Rouseff RL. Flavanone
absorption after naringin, hesperidin, and citrus administration. Clin
Pharmacol Ther 1996; 60:34-40;
Back DJ, Tjia JF. Comparative effects of the antimycotic drugs ketoconazole,
fluconazole, itraconazole and terbinafine on the metabolism of cyclosporin by
human liver microsomes. Br J Clin Pharmacol 1991; 32:624-634;
Bailey DG, Arnold JM, Munoz C, Spence JD: Grapefruit juice-felodipine
interaction: mechanism, predictability and effect of naringin. Clin Pharmacol
Ther 1993; 53:637-642;
Bailey DG, Arnold JM, Strong HA, Munoz C, Spence JD: Effect of grapefruit
juice and naringin on nisoldipine pharmacokinetics. Clin Pharmacol ther
1993; 54:589-559;
Bailey DG, Arnold JMO, Munoz C, Spence JD. Grapefruit juice-felodipine
interaction: mechanism, predictability, and effect of naringin. Clin Pharmacol
Ther 1993; 53:637-642;
Bailey DG, Spence JD, Edgar B, Bayliff CD, Arnold JMO. Ethanol enhances
the hemodynamic effects of felodipine. Clin Investig Med 1989; 12:357362;
Bailey DG, Spence JD, Munoz C, Arnold JMO. Interaction of citrus juices
with felodipine and nifedipine. Lancet 1991; 337:268269;
Boullata JI. Influence of medication on nutritional status. In: Bendich A,
Deckelbaum RJ, eds. Preventive nutrition, 3rd edition. Totowa, NJ: Humana
Press, Inc., 2005: 833868;
Brueggemeier RW Aromatase, aromatase inhibitors, and breast cancer.
American Journal of Therapeutics 2001; 8:333-344;
Brueggemeier RW, Hackett JC and Diaz-Cruz ES: Aromatase Inhibitors in the
Treatment of Breast Cancer. Endocrine Reviews 2005; 26:331-345;
Carlini P, Bria E, Giannarelli D, Ferretti G, Felici A, Papaldo Pet al., New
aromatase inhibitors as second-line endocrine therapy in postmenopausal
patients with metastatic breast carcinoma. Cancer 2005; 104:1335-1342;
Carrington S, Frazer HC, Grapefruit. A~Z of Barbados Heritage. Macmillan
Caribbean. 2003; 9091;
Cerda JJ, Normann SJ, Sullivan MP: Inhibition of atherosclerosis by dietary
pectin in microswine with sustained hypercholesterolemia. Circulation 1994,
89:1247-1253;
Dahan A, Altman H: Food-drug interaction: grapefruit juice augments drug
bioavailability mechanism, extent and relevance. Eur J Clin Nutr 2004; 58:19;
Eagling VA, Back DJ, Barry MG. Differential inhibition of cytochrome P450
isoforms by the protease inhibitors, ritonavir, saquinavir and indinavir. Br J
Clin Pharmacol 1997; 44:190-194;
58

16. Edgar B, Regardh CG, Johnsson G, Johansson L, Lundborg P, Lfberg I et al.,
Felodipine kinetics in healthy man. Clin Pharmacol Ther 1985; 38:205-211;
17. Edwards DJ, Bellevue FH, Woster PM. Identification of 6,7dihydroxybergamottin, a cytochrome P450 inhibitor, in grapefruit juice. Drug
Metab Dispos 1996; 24:1287-1290;
18. Edwards DJ, Bernier SM: Naringin and naringenin are not primary CYP 3A
inhibitors in grapefruit juice. Life Sci 1996; 59:1025-1030;
19. Edwards DJ, Fitzsimmons ME, Schuetz EG: 6'7' dihydroxybergamottin in
grapefruit juice and sivelle orange juice: effects on cyclsporin disposition,
enetrocyte CYP3A4 and P-glycoprotein. Clin Pharmacol Ther 1999; 65:237244;
20. Fuhr U, Kummert AL. The fate of naringin in humans: a key to grapefruit
juice-drug interactions? Clin Pharmacol Ther 1995; 58:365-373;
21. Fuhr U, Maier A, Keller A, Steinijans VW, Sauter R, Staib AH. Lacking
effect of grapefruit juice on theophylline pharmacokinetics. Inter J Clin
Pharmacol Ther 1995; 33:311314;
22. Gillies PJ, Krul ES. Using genetic variation to optimize nutritional preemption.
J Nutr 2007; 137:270S274S;
23. Girennavar B, Jayaprakasha GK, Jifon JL, Patil S, Variation of bioactive
furocoumarins and flavonoids in different varieties of grapefruits and
pummelo, Eur Food Res Technol 2008; 226: 1269 1275;
24. Guthrie N, Carroll KK. Inhibition of mammary cancer by citrus flavonoids.
Adv Exp Med Biol 1998; 439:227-236;
25. Hagen RE, Dunlap WJ, Mizelle JW, Wender SH, Lime BJ, Albach RF,
Griffiths FP. A chromatographicfluorometric method for determination of
naringenin rutinoside, and related flavanone blycosides in grapefruit juice and
in juice sacs. Anal Biochem 1965; 12:472-482;
26. Halpert JR, Structural basis of selective cytochrome P450 inhibition. Annu Rev
Pharmacol Toxicol 1995; 35:2953;
27. Hukkinen SK, Varhe A, Olkkola KT, Neuvonen PJ. Plasma concentrations of
triazolam are increased by concomitant ingestion of grapefruit juice. Clin
Pharmacol Ther 1995; 58:127-131;
28. Kent UM, Juschyshyn MI, and Hollenberg PF, Mechanism-based inactivators
as probes of cytochrome P450 structure and function. Curr Drug Metab 2001;
2:215243;
29. Kordas K, Lonnerdal B, Stoltzfus RJ. Interactions between nutrition and
environmental exposures: effects on health outcomes in women and children. J
Nutr 2007; 137:27942797;
30. Koymans L, Moereels H and Vanden Bossche H A molecular model for the
interaction between vorozole and other non-steroidal inhibitors and human
cytochrome P450 19 (P450 aromatase), Journal of Steroid Biochemistry and
Molecular Biology 1995; 53:191-197;
59

31. Kupferschmidt HH, Ha HR, Ziegler WH, Meier PJ, Krahenbuhl S: Interaction
between grapefruit juice and midazolam in humans. Clin Pharmacol Ther
1995; 58:20-28;
32. Leemann T, Transon C, and Dayer P, Cytochrome P450TB (CYP2C): a major
monooxygenase catalyzing diclofenac 4_-hydroxylation in human liver. Life
Sci 1993; 52:2934;
33. Lown K, Bailey DG, Fontana RJ. Grapefruit juice increases felodipine oral
availability in humans by decreasing intestinal CYP3A protein expression. J
Clin Invest 1997; 99: 2545-2553;
34. Lundahl J, Regardh CG, Edgar B, Johnsson G. Effects of grapefruit juice
ingestion pharmaco-kinetics and haemodynamics of intravenously and orally
administered felodipine in healthy men. Eur J Clin Pharmacol 1997; 52:139
145;
35. Lundahl J, Regardh CG, Edgar B, Johnsson G. Relationship between time of
intake of grapefruit juice and its effect on pharmacokinetics and
pharmacodynamics of felodipine in healthy subjects. Eur J Clin Pharmacol
1995; 49:6167;
36. Masubuchi Y, Ose A, and Horie T, Mechanism-based inactivation of
CYP2C11 by diclofenac. Drug Metab Dispos 2001; 29:11901195;
37. Miniscalco A, Lundahl J, Regrdh CG, Edgar B, Eriksson UG. Inhibition of
dihydropyridine metabolism in rat and human liver microsomes by flavonoids
found in grapefruit juice. J Pharmacol Exp Ther 1992; 261:1195-1199;
38. Murray M. Mechanisms and significance of inhibitory drug interactions
involving cytochrome P450 enzymes (Review). Int J Mol Med 1999; 3:227238;
39. Paine MF, Shen DD, Kunze KL, Perkins JD, Marsh CL, McVicar JP et al.,
Firstpass metabolism of midazolam by the human intestine. Clin Pharmacol
Ther 1996; 60:14-24;
40. Paine MF, Widmer WW, Hart HL. A furanocoumarin-free grapefruit juice
establishes furanocoumarins as the mediators of the grapefruit juicefelodipine
interaction. Am J Clin Nutr 2006; 83:10971105;
41. Rashid J, McKinstry C, Renwick AG, Dirnhuber M, Waller DG, George CF et
al., Quercetin, an in vitro inhibitor of CYP3A, does not contribute to the
interaction between nifedipine and grapefruit juice. Br J Clin Pharmacol 1993;
36:460-463;
42. Ren S, Yang JS, Kalhorn TF, Slattery JT. Oxidation of cyclophosphamide to
4-hydroxy-cyclophosphamide and deschoroethylcyclophosphamide in human
liver microsomes. Cancer Res 1997; 57:429435;
43. Ribeiro AI, Ribeiro MHL, Naringin and naringenin determination and control
in grapefruit juice by a validated HPLC method, Food Control 2008; 19 (4),
432-438;
44. Roe AD, Liss AR Drug-Nutrient Interactions. Inc., New York, 1981
60

45. Ross SA, Ziska DS, Zhao K, ElSohly MA: Variance of common flavonoids by
brand of grapefruit juice. Fitoterapia 2000; 71:154-161;
46. Rushmore TH, Kong A-NT. Pharmacogenomics, regulation and signaling
pathways of phase I and II drug metabolizing enzymes. Curr Drug Metab
2002; 3:481490;
47. Salazar JA, Poon I, Nair M. Clinical consequences of polypharmacy in elderly:
expect the unexpected, think the unthinkable. Expert Opin Drug Saf 2007;
6:695704;
48. Schmiedlin-Ren P, Edwards DJ, Fitzsimmons ME, He K, Lown KS, Woster
PM et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by
grapefruit juice constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and
mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab Dispos 1997;
25:1228-1233;
49. Shen S, Marchick MR, Davis MR, Doss GA, and Pohl LR, Metabolic
activation of diclofenac by human cytochrome P450 3A4: role of 5hydroxydiclofenac. Chem Res Toxicol 1999; 12:214222;
50. So FV, Guthrie N, Chambers AF, Moussa M, Carroll KK. Inhibition of human
breast cancer cell proliferation and delay of mammary tumorigenesis by
flavonoids and citrus juices. Nutr Cancer 1996; 26(2):167-181;
51. Tang W, Stearns RA, Kwei GY, Iliff SA, Miller RR, Egan MA, et al.,
Interaction of diclofenac and quinidine in monkeys: stimulation of diclofenac
metabolism. J Pharmacol Exp Ther 1999a; 291:10681074;
52. Tang W, Stearns RA, Wang RW, Chiu SH, and Baillie TA Roles of human
hepatic cytochrome P450s 2C9 and 3A4 in the metabolic activation of
diclofenac. Chem Res Toxicol 1999b; 12:192199;
53. Uno T, Ohkubo T, Sugawara, Effects of grapefruit juice on the stereoselective
disposition of nicardipine in humans: evidence for dominant presystemic
elimination at the gut site. Eur J Clin Pharmacol. 2000; 56(9-10): 643-649;
54. Ushijima K, Koshimizu T, Fujimura A. The inhibitory effect of cranberry
juice on phenytoin metabolism by human liver microsomes. Jpn J Clin
Pharmacol Ther. 2009; 40:59-64;
55. Yan Z, Li J, Huebert N, Caldwell GW, Du Y, Zhong H, et al., Detection of a
novel reactive metabolite of diclofenac: evidence for cyp2c9-mediated
bioactivation via arene oxides, Drug Metabolism & Disposition 2005; 33(6):
706-713;
56. Yee GC, Stanley DL, Pessa LJ, Dalla Costa T, Beltz SE, Ruiz J et al. Effect
of grapefruit juice on blood cyclosporin concentration. Lancet 1995; 345:955956;
61
LISTA ARTICOLE PUBLICATE

1. Camelia Harapu Diaconu, Magdalena Cuciureanu, L. Vlase, Rodica
Cuciureanu, Food- Drug Interactions: Grapefruit Juice, Rev. Med. Chir.
Soc. Med. Nat, Iai, 2011; 115(1): 245-249.
2. Camelia Diaconu Harapu, Anca Miron, Magdalena Cuciureanu, Rodica
Cuciureanu, Flavonoidele - Componente Bioactive din sucuri de fructe,
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai, 2010,114(4): 1209-1214.
3. Harapu Camelia, Vlase Laurian, Cuciureanu Magdalena, Cuciureanu
Rodica, Interaciuni farmacocinetice suc de grapefruit - medicamente
antiinflamatoare nesteroidiene (diclofenac si celecoxib), Rev. Med. Chir.
Soc. Med. Nat., Iai, 2009; 113(2), supl.(4); CDrom.
4. Harapu Camelia, Vlase Laurian, Muntean Dana, Cuciureanu Magdalena,
Nechifor Mihai, Cuciureanu Rodica, Determination of diclofenac in rat
plasma by HPLC/MS and its application to pharmacokinetic studies,
European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics; 2009; 34;
indexare Medline; CDrom.
5. Harapu Camelia, Vartolomei Anca, Cuciureanu Rodica, Sucul de grapefruit
- Studiu comparativ al coninutului in compui bioactivi, Reuniunea
Naionala de Istoria Farmaciei, Volumul de rezumate, 2009 (ISBN 978973-8932-44-9), Editura Tehnoplast Company SRL, (acreditare CNCSIS
1152/23.06.2004).
6. Harapu Camelia, Vlase Laurian, Cuciureanu Magdalena, Muntean Dana,
Cuciureanu Rodica, Interaction between grapefruit juice and diclofenac; a
pharmacokinetic study, AL IX-lea Simpozion de biofarmacie si
farmacorinetica, 2010, Acta Medica Marisiensis, 56, supl. (2);(ISSN 20683324).
62

Rezumat Diaconu (Harapu) Camelia

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezumat Diaconu (Harapu) Camelia

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

STUDIUL UNOR INTERACIUNI

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

In topul celor mai sntoase fructe, grapefruitul este campion, un

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

anticipate pe baza aciunii farmacologice a medicamentelor administrate. Pe

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

structuri asemntoare sunt potenial inhibitoare ale P-glicoproteinei, cnd sunt

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

diclofenac administrate per os (1 mg, 2,5mg i respectiv 10mg/kg corp),

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

temeinice privind rezultatele asocierilor medicamentoase, a interaciunilor i

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Efectele malnutriiei asupra absorbiei, transportului, metabolizrii i

II.2. INTERACIUNI ALIMENT-MEDICAMENT. DOMENII

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

cu dezvoltarea unor interaciuni directe sau indirecte cu nutrienii; aceste

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

influena parametrii farmacocinetici i farmacodinamici i pentru alte medicamente

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

II.4.2.2. Componente bioactive din sucul de grapefruit

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

enzimelor CYP includ antifungice cu structur imidazolic ketoconazol i

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

felodipinei la dehidrofelodipin i a acesteia, mai departe ntr-un metabolit

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

II.4.5.1. Ingrediente active din sucul de grapefruit flavonoide i

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Aprofundarea cercetrilor n scopul descifrrii mecanismului

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig.III.7. Blank de plasma pentru testarea specificitatii

Fig.III.8. Cromatograma unei probe cu diclofenac, la limita de cuantificare

Fig.III.9. Curba de calibrare a diclofenacului

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

III.2.4.4. Limita inferioar de cuantificare

III.2.4.5. Precizia i acurateea

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

III.3. STUDIUL INTERACIUNII FARMACOCINETICE

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig. III.10. Profiluri plasmatice ale diclofenacului administrat singur,

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Analiza farmacocinetic s-a realizat cu ajutorul unui program de

Analizand rezultatele analizei farmacocinetice efectuate, se poate

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

parametru ce se coreleaz cu cantitatea de substan ce ajunge n circulaia

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

reducerea glutationului, sugernd c diclofenacul provoac o inactivare de tip

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Coloana : Zorbax SB-C18 100x3.0 mm, 3.5 m

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

fragmentare, ionul pesudo-molecular al naringeninei se scindeaza in ionii cu