Coagularea:

fiziologie și explorare

Dr. Andra Costache MD PhD

1
 Coagularea
reprezintă procesul de activare în cascadă a
factorilor plasmatici ai coagulării, cu scopul final
de formare a rețelei de fibrină care va consolida
agregatele trombocitare și va realiza o
hemostază eficientă

rezultatul final: transformarea fibrinogenului

solubil în fibrină insolubilă

formarea trombinei este elementul central al

activității coagulante
2
 Factorii de coagulare

factorii de coagulare sunt proenzime / proteine precursor inactive/

zimogeni, cofactori enzimatici și substraturi prin a căror activare se
formează cheagul de fibrină

zimogenii vor fi activați printr-un proces de proteoliză limitată

toți acești factori sunt sintetizați la nivel hepatic de către hepatocite

FVIII poate fi sintetizat și la nivelul sistemului reticulo-endotelial

FV, FVIII și Fbg sunt sintetizați și la nivelul trombocitelor sau

celulelor endoteliale

sinteza FII, FVII, FIX, FX este vit.K dependentă (gama carboxilare în

prezența vitaminei K)
Factorul de coagulare Sinonime

Fibrinogen Factor I

Protrombina Factor II

Factor tisular Factor III, Tromboplastină tisulară

Calciu Factor IV

Factor V Proaccelerină, Factor labil, Ac-globulină

Factor VII Acceleratorul conversiei protrombinei

serice, Proconvertin, Factor stabil

Factor VIII Factor antihemofilic, Globulină

antihemofilică, Factor antihemofilic A

Factor IX Factor antihemofilic B, Factor Christmas

Factor X Factor Stuart, Factor Stuart-Prower

Factor XI Factor antihemofilic C

Factor XII Factor Hageman

Factor XIII Factorul de stabilizare a fibrinei

Prekalikreina Factor Fletcher

HMW Kininogen Factor Fitzgerald

Trombocitele
 Factorul tisular (TF)

principalul inițiator fiziologic al coagulării

inițiază coagularea pe calea extrinsecă

Se exprimă constitutiv la nivelul barierelor fiziologice:

piele, suprafața organelor, adventicea vasculară,
suprafețele epiteliale-mezenchimale.

Se află în formă inactivă, encriptică

În cazul unei leziuni vasculare, este expusă

fosfatidilserina și TF devine decriptat și activat, având
capacitatea de a activa FVII
calciul este un cofactor necesar pentru
aproape toate etapele coagulării

fosfolipidele (de la suprafața trombocitelor

activate)

factorul de contact: Kininogen cu greutate

moleculară mare (HMWK), prekalikreină și FXII
 HMWK

HMWK nu este activ enzimatic, funcționează

doar ca și cofactor pentru activarea
prekalikreinei și a FXII.

Este necesar și pentru activarea FXI de către

FXIIa.
 Prekalikreina

sintetizată hepatic, circulă în plasmă legată de

HMWK

prekalikreina plasmatică este implicată într-o

serie de recții în cascadă: coagularea pe calea
intrinsecă, sistemul kalikreină-kinină, sistemul
fibrinolitic, sistemul renină-angiotensină, calea
alternă a complementului

are rol în statusul procoagulant și proinflamator

Etapele clasice ale coagulării

calea extrinsecă

calea intrinsecă

calea alternativă

calea comună
 Calea extrinsecă

TF exprimat la nivelul țesutului lezat sau

subendoteliului se leagă la și activează FVII

Complexul TF-FVIIa activează FX (calea

comună)
 Calea intrinsecă

calea intrinsecă se activează ca urmare a expunerii sângelui la suprafețe

străine încărcate electronegativ.

Se formează un complex de inițiere la suprafața colagenului expus (factorul

de contact): kininogenul cu greutate moleculară mare (HMWK-high
molecular weight kininogen), prekalikreină și FXII.

FXII se leagă de macromolecule electronegative, se activează

FXIIa convertește prekalikreina în kalikreină, care va activa și mai mult FXII

activarea de contact determină și activarea fibrinolizei

activarea FXII este urmată de activarea în cascadă a FXI și apoi a FIX;

FVIIIa servește ca și cofactor al FIXa, împreună determinând activarea căii

comune
 Calea alternativă

TF-FVIIa acționează direct asupra FIX și îl

activează
 Calea comună

calea comună este inițiată prin activarea FX fie

de către FVIIa, fie de către FIXa;

FV servește ca și cofactor al FXa, împreună

activând protrombina la trombină, care va
transforma fibrinogenul în fibrină.

Monomerii de fibrină for fi stabilizați prin

intervenția FXIII
Cascada coagulării
Cascada coagulării
Conceptul actual al coagulării

procesul de coagulare poate fi împărțit în trei

etape care se suprapun:

• inițierea

• amplificarea

• propagarea și stabilizarea cheagului

Conceptul actual al coagulării
odată apărută o leziune vasculară, hemostaza începe prin aderarea
inițială a trombocitelor la colagenul din subendoteliu prin
intermediul VWF

trombocitele agregate posedă o suprafață fosfolipidică încărcată

negativ

inițial proteaza cheie a coagulării se formează în cantitate mică pe

calea extrinsecă (dependent de TF)

urmează amplificarea formării trombinei prin feed-back pozitiv,

mediat de ea însăși (calea intrinsecă)

odată ce au fost generate cantități suficiente de trombină, se

formează fibrina care va stabiliza trobusul
 Inițierea coagulării

TF joacă un rol cheie în faza de inițiere ca trigger fiziologic al coagulării în condițiile

unei leziuni vasculare care permite contactul plasmei cu celulele extravasculare care
exprimă TF

complexul format din TF-FVIIa, prezența fosfolipidelor și a ionilor de calciu vor

genera cantități inițiale de FXa

acest FXa va fi încorporat în complexul protrombinazic (FXa, FVa, Ca) și va genera

cantități inițiale mici de trombină

cantități mai mari de complex TF-FVIIa pot determina generarea FIXa

cantitatea mică de trombină generată inițial este insuficientă pentru a genera fibrină
la acest moment, însă este capabilă sa inducă activarea FXI și a cofactorilor FVIII și
FV pentru a stimula propria formare (amplificare pe calea intrinsecă)

se realizează o amplificare enormă spațio-temporală a căii intrinseci printr-un

mecanism de feed-back pozitiv, producându-se cantități crescute de trombină,
suficiente pentru generarea fibrinei și activarea FXIII.
 Amplificarea

complexul VWF/FVIII se leagă la trombocite și este clivat de către trombina din

faza de inițiere, cu activarea FVIII și eliberarea VWF: FVIIIa rămâne legat la
suprafața trombocitelor, în timp ce VWF favorizează aderarea trombocitelor la
suprafețe trombogenice

trombina activează FXI la suprafața trombocitelor; FXIa activează FIX la suprafața

trombocitelor activate. FIX mai poate fi activat pe calea extrinsecă de către
complexul TF-FVIIa

ca urmare a activării, trombocitele eliberează FV care este activat de către

trombină

FIXa împreună cu FVIIIa formează complexul tenazic care crește activarea FX la

locul leziunii vascualre

FXa împreună cu FVa formează complexul protrombinazic, care, împreună, la

nivelul suprafeței fosfolipidice a trombocitelor activate vor converti protrombina
în trombină, astfel amplificând cantitățile de trombină produse în faza de inițiere
 Amplificarea

FXa împreună cu cofactorul FVa, la nivelul suprafeței

fosfolipidice a trombocitelor activate convertesc
protrombina în trombină

complexul protrombinazic are capacitatea de a

converti cantități mari de protrombină la trombină,
astfel amplificând cantitățile de trombină generate în
faza de inițiere

trombina își stimulează propria formare prin feed-

back: activează cofactorii FV și FVIII și activează
factorul FXI
 Propagarea

în faza de propagare, trombina clivează

fibrinogenul formând fibrină solubilă și eliberând
două perechi de fibrinopeptide A și B per
moleculă de fibrinogen

stabilizarea dopului plachetar se produce prin

polimerizarea monomerilor de fibrină (prin
legături de hidrogen)

polimerii de fibrină vor forma o rețea de fibrină

insolubilă care va stabiliza agregatul plachetar
 Stabilizarea

monomerii de fibrină se leagă spontan prin

legături de hidrogen, formănd polimeri de
fibrină insolubilă

trombina are rol în stabilizarea cheagului de

fibrină, activând FXIII în prezența Ca2+

FXIII realizează legături covalente între

monomerii de fibrină, stabilizând cheagul
 Funcții ale trombinei

Agonist trombocitar

Activeaza FV, FVIII, FXI ➔ stimulează propria

formare prin feed-back pozitiv

Fibrinoformare (desprinde din molecula de

fibrinogen FpA si FpB)

Stabilizarea cheagului de fibrină prin activarea FXIII

Activator al PC
 Explorarea hemostazei
secundare

PRINCIPIUL TESTELOR DE COAGULARE:

recoltarea sângelui pe anticoagulant –
blocarea ionilor de calciu – blocarea coagulării

IN VITRO - se reia coagularea în plasmă

adăugând CALCIU + FACTOR TISULAR/
CEFALINĂ/TROMBINĂ

se măsoară timpul de apariție a cheagului

Condiții de lucru în hemostază
- recoltarea
dimineața, a jeun (12h, ultima masă făra grăsimi), pacient relaxat, la temperatura camerei

stază venoasă moderată, sub 1 min. (risc de activare a fibrinolizei, hemoconcentrare)

traumatizarea minimă a venei (poate elibera tromboplastină)

Puncție venoasă fermă

NU branulă, cateter (mai ales heparinizate)

NU spumuire, nu agitare

Omogenizare prin inversiune – de min. 4 ori (altfel risc de hemoliza, activare trombocitară)

Recipiente speciale (vacutainer) – sticlă siliconată, plastic

Cantitatea recoltată

Proporția cu anticoagulantul (1:9)

 Anticoagulanții

CITRAT DE SODIU 3,8%/ 3,2% - împiedică

ionizarea calciului

OXALAT DE SODIU – precipită calciu și îl

blochează; alterează trombocitele și unii factori
de coagulare (FV, FVIII)

EDTA – pentru HLG, păstrează morfologia

elementelor figurate (alterează factorii de
coagulare)
ORDINEA EPRUBETELOR:

hemoculturi

ser (dop roșu)

coagulograma (citrat de sodiu 3,2% - dop

albastru)

hemoleucograma (EDTA - dop mov)

VSH – citrat de sodiu

TRANSPORT la temperatura camerei

CENTRIFUGARE imediată (max. 1 ora)

PRP – 150 g 10min.

PPP – 2000 g 15min.

Separarea supernatantului – recipiente de plastic

Timp de lucru – max 2 ore pentru trombocit, 3-4 ore

pentru coagulogramă
PĂSTRAREA PROBELOR – la temperatura camerei,
nu la frigider

CONGELARE în max. 2 ore, dupa dubla centrifugare;

aliquotare în volume mici pentru congelare rapida la
-20°C

Timp de pastrare – 1 lună la -20°C, 6 luni la -70°C

Decongelare rapidă la 37°C

Timp de lucru 2 ore

Timpul de protrombină /PT/
Timpul Quick

Timpul de coagulare a unei plasme sărace în

trombocite (PPP) la adăugarea de Calciu și
Tromboplastină (factor tisular)

Tehnica: PPP (50μl) + Tromboplastină calcică

(100 μl)

VN = 12-15 SEC.
PT
 Scurtarea PT

nu poate cuantifica starea de

hipercoagulabilitate

fiziologic în sarcină

suplimentarea vit. K

transfuzie cu plasmă proaspătă congelată

calibrare nepotrivită
 Alungirea PT

patologia căii extrinseci și a căii comune

tratament anticoagulant oral cumarinic

deficit de vit. K (malnutriție, obstrucție biliară, malabsorbție, antibiotice)

hepatopatie - indicator sensibil al suferinței hepatice acute sau cronice

deficiență de factor VII, X, II, V sau fibrinogen

prezența de inhibitori

CID

anomalii ale fibrinogenului (hipo-, a-, dis-fibrinogenemie)

tranzitor după administrarea de heparină în bolus

după transfuzii masive, datorită diluției proteinelor plasmatice ale coagulării

hipotermie- inhibarea unor reacții enzimatice

 PT

Este utilizat pentru monitorizarea terapiei

anticoagulante orale

Principalul reactiv utilizat = tromboplastina –

factorul tisular a cărui sensibilitate variază
foarte mult ceea ce conduce la variații foarte
mari ale rezultatelor PT
 Standardizarea PT

Activitatea de Protrombină (AP) = raportarea PT-

ului pacientului la PT-ul unei plasme normale

Curba de calibrare: diluții seriale ale unei

plasme normale (3-5 puncte de calibrare)

Considerăm că plasma normală nediluata are

AP=100%,

3/4 = 75%; 1/2 = 50%; 1/4 = 25%; 1/8 = 12,5%

PT - curba de calibrare
PT - curba de calibrare
INR (International Normalized
Ratio)
tromboplastina (Factor Tisular) - reactiv a cărui sensibilitate variază foarte
mult, determinând variații mari ale rezultatelor PT

ISI - indice internațional de sensibilitate al tromboplastinei folosite calculat

în raport cu tromboplastina de referință pentru care ISI=1

INR = (PT pacient/PT mediu plasmă normală)ISI

INR este util numai pentru pacienții cu terapie anticoagulanta orală de tip
cumarinic

în scop profilactic INR=2-3

în scop terapeutic INR=2.5-3.5/4

validat numai pentru pacienții cu terapie anticoagulantă orală, nu pt. afectare

hepatică
 PT

Indicele de protrombină - raportul PT pacient/

PT normal mediu

Alegerea PT normal

Stabilirea intervalului de normalitate

 PT- interferențe

hematocrit ↑ (PV, SMD, cardiopatii congenitale

cianogene)➞scade conținutul de plasmă al probei
și se modifică raportul cu citratul➞PT fals alungit

heparina poate prelungi PT prin inhibarea

trombinei (în caz de recoltare de pe cateter
heparinizat sau după bolus cu heparină)

turbiditatea plasmei (hiperlipidemie severă,

hiperbilirubinemie, hemoliză) ➞ PT fals (metoda
de determinare e foto-optică)
TIMPUL DE CEFALINĂ/ PTT/
APTT
timpul de coagulare a unei plasme sărace în trombocite la adaos
de calciu si cefalină (înlocuitor al fosfolipidelor trombocitare)

Timp de Tromboplastină Parțială (PTT)

Timp de Tromboplastină Parțială cu Activator (aPTT) – se adaugă

și un activator al factorului de contact care grăbește timpul de
apariție a cheagului, rezultând un interval de referință mai îngust

Reactivul APTT este un amestec de fosfolipide (de origine

umana, animala sau vegetala) și un activator al factorului de
contact (kaolin, acid elalgic, particule de siliciu, etc.)

este considerat mai sensibil decât PTT

 PTT/aPTT

TEHNICA : (părți egale) PPP + Cefalină/

Cefalină + Activator + Calciu

VN = 35-55 sec. (PTT)

VN = 25-35 sec. (aPTT)

valori de alertă: aPTT>70 sec. sau PTT>100sec.

risc de hemoragie spontană!
aPTT
 Scurtarea PTT/aPTT

nu poate cuantifica hipercoagulabilitatea

în stadiile incipiente ale CID pot exista

procoagulanți circulanți care scurtează APTT

cancere extinse (ovarian, pancreatic, de colon)

imediat după hemoragie acută

răspuns de fază acută care determină creșterea

nivelului FVIII
 Alungirea PTT/aPTT
patologia căii intrinseci și a căii comune

deficit congenital pe calea intrinsecă (FVIII, FIX, FXI, FXII)

deficit congenital de prekalikreină

boala von Willebrand

hipofibrinogenemie

ciroza hepatică

deficit de vitamină K

CID

heparinoterapie

terapie anticoagulantă orală

prezența de inhibitori nespecifici ( de ex. lupus anticoagulant și antic. anticardiolipinici care se leagă
la fosfolipidele de la suprafața trombocitelor)

anticoagulanți circulanți specifici (anticorpi inhibitori împotriva anumitor factori de coagulare (la pac.
cu hemofilie după multe transfuzii de plasmă, LES, artrită reumatoidă, TBC, glomerulonefrită cronică).
 aPTT

APTT se utilizează în monitorizarea

heparinoterapiei cu UFH, nu și pentru LMWH

interval optim terapeutic: 1,5-2,5x media

intervalului de normalitate
 aPTT - interferențe

medicamente care pot alungi APTT:

antihistaminice, acid ascorbic, clorpromazină,
heparină, salicilați

raport incorect sânge/citrat

hematocrit ↑↑↑ sau ↓↓↓

probe recoltate de pe cateter heparinizat

 Timpul de trombină (TT)

Timpul de coagulare a unei plasme sărace în

trombocite la adăugarea de TROMBINĂ.

Reia coagularea de la trombină în jos

VN = 15-18 sec.
Timpul de trombină (TT)
 Alungirea timpului de
trombină (TT)
anomalii ale fibrinogenului (hipofibrinogenemie
severă <0.7-1 g/L, afibrinogenemie,
hiperfibrinogenemie severă >14 g/L,
disfibrinogenemie)

anomalii ale formării fibrinei: CID (prezența PDF, DD),

proteine circulante anormale (amiloidoză, mielom)

inhibitori ai trombinei (heparină, hirudină, inh. direcți

ai trombinei, antic. circulanți anti-trombină)

CID și fibrinoliza primară

 Timpul de trombină

primul pas în evaluarea unor teste APTT sau

PT alungite

↓ albuminei (<30 g/L) în plasmă → alungirea TT

datorită întârzierii polimerizării fibrinei
 Timpul de reptilază

Timpul de coagulare a unei plasme sărace în

trombocite la adăugarea de REPTILAZĂ = un
venin de șarpe cu proprietăți trombin-like dar
care e rezistent la acțiunea antitrombinelor

VN = 11-13 SEC.

Prelungirea sa – patologia fibrinogenului

Se lucrează în paralel cu TT și se coroborează.

 Mixing test

se utilizează în cazul unor timpi alungiți de coagulare (PT/APTT/TT)

pentru a face distincția între deficit de factor sau prezența de
inhibitori

se bazează pe faptul că dacă nivelul unui factor de coagulare este

50% din valoarea normală, testele de coagulare care îl explorează
(PT/ APTT/TT) sunt normale

plasma pacientului este mixată cu plasmă normală în rport 1/1

se testează imediat (PT/APTT/TT) și după incubare 2h la 37 ºC

dacă rezultatul se corectează ➞ există un deficit de factor

dacă nu se corectează ➞ prezența de inhibitori

 Inhibitorii

specifici pentru anumiți factori de coagulare

lupus-like (anticorpi antifosfolipidici)

nespecifici (ex. imunoglobuline monoclonale)

 Alte metode de explorare a
coagulării

dozarea factorilor plasmatici ai coagulării (I-

XIII) prin metode:

• coagulometrice

• cromogenice

• imunologice
 Metodele coagulometrice

Folosesc plasme deficitare în factorul pe care dorim să-l dozăm

plasma deficitară se mixează cu plasma pacientului

Reproduc coagularea pe calea corespunzătoare factorului

urmarit (ex. APTT pentru FVIII, FIX; PT pentru FVII)

timpul de coagulare obținut se extrapolează pe o curbă de

calibrare realizată pe o plasmă normală mixată cu plasmă
deficitară (mai multe diluții)

sensibilitate mai scazută fata de celelalte metode

pot depista defectele calitative ale factorilor de coagulare

 Metodele cromogenice

Se bazează pe proprietatea enzimatică a factorilor

coagulării de a modifica un substrat cromogenic

Modificarea de culoare (ΔOD) este direct

proporțională cu cantitatea factorului de coagulare
urmărit

au sensibilitate și precizie mai bune decât testele

coagulometrice

pot diagnostica atât tulburări cantitative, cât și

calitative
 Metodele imunologice

Folosesc anticorpi anti factor de coagulare, cuplați pe

particule latex

Formarea complexelor antigen(=factor) – anticorp duce la

aglutinarea particulelor latex ➔ teste imunoturbidimetrice/
teste rapide -latex

Variația transmisiei optice (produsă prin latex-aglutinare)

este direct proporțională cu cantitatea de factor urmărit

Nu pot diagnostica tulburările calitative (funcționale)

Metodele imunoturbidimetrice sunt cele mai exacte

Dozarea Fibrinogenului - Fbg
derivat din curba PT
pentru determinarea PT se determină timpul de apariție a
cheagului;

pe aceeași reacție se pot obține informații despre cantitatea

de Fbg;

pe baza caracteristicilor de transmisie optică ale cheagului

se poate doza Fbg (ΔOD).

Când se efectuează curba de calibrare pentru PT se ia în

considerare și cantitatea de Fbg.

Limite care ține de cantitatea de Fbg (0.6-6 g/dL). În afara

acestui interval se folosește altă metodă.
 Dozarea Fibrinogenului -
Metoda Clauss

metodă coagulometrică pentru determinarea Fbg

acțiunea trombinei bovine: transformă Fbg în fibrină

densitatea optică a cheagului rezultat e d.p. cu

cantitatea de Fbg

calibrarea - similar cu PT: diluții seriale ale unei

plasme cu cantitate cunoscută de Fbg

VN = 2-4 g
 Fbg

Fibrinogenul = proteina de fază acută; utilizat

ca și marker de inflamație

Valori crescute: infecții, inflamații, colagenoze,

RAA, neoplazii, postoperator, în sarcină

Valori scăzute: boli hepatice severe, tulburări

cantitative congenitale (rar), CID, fibrinoliză
primară
Teste de hipercoagulabilitate

Monomerii de fibrină

Complexele trombină-antitrombină (TAT)

Fragmentul protrombinic F1+2 (F1+2) (protrombină →

trombină + F1+2)

fibrinopeptidul A (FPA) și B (FPB) (Fbg → Monomeri de

fibrină +A+B)

PCP (peptid de clivare din molecula de PC activată)

Testul de activare reziduală în ser – TARS

Testul activării reziduale în ser
(TARS)

Principiu: în reacția de coagulare unii factori ai

coagulării se consumă integral (fibrinogenul,
FVIII, FV) alții se consumă parțial (FII, FX) iar
alții rămân integral în ser (XII, XI, IX, VII)

Reacția de coagulare a unui amestec de

plasmă și ser – evaluează activitatea factorilor
de coagulare rămași în ser
 Trombelastografia

metodă de testare a eficienței coagulării

importantă în special în chirurgie și ATI

metoda clasică: proba de sânge este plasată într-o cuvetă care se rotește
și imită fluxul venos încet și activează coagularea; când este introdus un
senzor în probă se formează un cheag între cuvetă și senzor

este măsurată viteza de formare și rezistența cheagului

depinde de sistemul de coagulare, funcția trombocitară, fibrinoliză

pattern-ul modificărilor în rezistența și elasticitatea cheagului oferă

informații despre statusul hemostazei

se calculează un index de coagulare

CAT (Calibrated Automated
Thrombogram)

trombograma cu calibrare automată este un

test funcțional de explorare a hemostazei

se evaluează producția/generarea de trombină

evaluează atât riscul trombotic, cât și cel

hemoragic

metodă fluorimetrică