Sunteți pe pagina 1din 52

Spectroscopie moleculară UV-VIS

II.4.

SPECTROSCOPIA MOLECULARĂ

II.4.1. Bazele teoretice

Exista trei procese de bază prin care o moleculă poate absoarbi energie:

- prin rotaţie - molecula se roteşte după axe variate, energia de rotaţie fiind la nivele energetice bine definite. Atunci cînd molecula absoarbe energie, ea poate trece la nivele energetice de rotaţie mai ridicate printr-o tranziţie rotaţională;

- prin vibraţie - atomii sau grupele de atomi din interiorul unei molecule vibrează relativ unii faţă de ceilalţi. Energia acestor vibraţii se găseşte şi ea pe nivele energetice precise, cuantificate. Prin absorbţia unei cantităţi discrete de energie, molecula se poate ridica la un nivel vibraţional mai ridicat printr-o tranziţie vibraţională;

- pe cale electronică - electronii unei molecule pot să ajungă la nivele energetice mai înalte ca urmare a unei tranziţii electronice de pe un nivel energetic inferior pe un nivel energetic superior (vezi şi capitolul II.1.1.2.);

179

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Toate cele trei modalităţi de absorbţie a energiei sînt cuantificate, ele presupun absorbţii de cuante de energie hn şi creşterea corespunzătoare a nivelului energetic al moleculei. Aceste tranziţii sînt ilustrate în figura II.4.1. pe

Aceste tranzi ţ ii sînt ilustrate în figura II.4.1. pe Fig.II.4.1. Schema de principiu pentru ilustrarea

Fig.II.4.1. Schema de principiu pentru ilustrarea pe baza nivelurilor energetice ale absorbţiei de energie cuantificată de către o moleculă. A-tranziţie rotaţională (infraroşu îndepărtat), B- tranzitie vibraţională (infraroşu apropiat), C-tranziţie electronică (vizibil şi ultraviolet). E 0 -energia stării fundamentale, E 1 - energia stării excitate

baza modelului nivelurilor energetice. Energiile relative ale celor trei procese de tranziţie într-o moleculă sînt în ordine descrescătoare, electronic - vibraţional -rotaţional, astfel:

180

Spectroscopie moleculară UV-VIS

- tranziţiile rotaţionale au loc la nivele energetice foarte scăzute (lungimi de undă mari, specifice microundelor sau infraroşu îndepărtat, lungimi de undă ce sînt cuprinse între 100 mm şi 10 cm);

- tranziţiile vibraţionale necesită energii mai mari şi se plasează în domeniul infraroşu apropiat;

- tranziţiile electronice necesită energii mult mai mari ceea ce le plasează în domeniul vizibil şi ultraviolet; La temperatura obişnuită a mediului se consideră că molecula este în starea energetică cea mai scăzută, E 0 , denumită stare fundamentală. Tranziţia pur rotaţională va avea loc numai din această stare fundamentală, figura II.4.1.(A). Atunci cînd au loc tranziţii pur rotaţionale, în spectru vor apărea linii drepte discrete de absorbţie, lungimea de undă a fiecărei linii corespunzînd unei tranziţii particulare. Din punct de vedere analitic tranziţiile rotaţionale pure nu prezintă o importanţă atît de mare. Dacă energia absorbită creşte (lungimea de undă descreşte), pe lîngă tranziţiile rotaţionale apar şi tranziţii vibraţionale rezultînd diferite combinaţii ale regimului roţational – vibraţional cu foarte multe valori. Fiecare nivel de rotaţie al celui mai scăzut nivel vibraţional poate fi excitat la diferite nivele rotaţionale ale nivelului vibraţional excitat, figura II.4.1.(B), în plus ar putea exista cîteva nivele vibraţionale, fiecare cu un anumit număr de nivele rotaţionale. Aceasta conduce la numeroase tranziţii discrete, rezultatul fiind un spectru cu o densitate extrem de mare de linii astfel încît acestea nu se pot distinge şi percepe clar. Din cauza suprapunerii tranziţiilor rotaţionale peste cele vibraţionale, cu toate că tranziţiile vibraţionale sînt tot discrete, spectrul de vibraţie apare ca o structură de peak-uri continue în care nu se pot diferenţia liniile discrete. Lungimile de undă la care se formează aceste peak - uri pot fi puse în corespondenţă cu modurile de vibraţie în interiorul moleculei. Acestea au loc in infraroşu mijlociu şi îndepărtat

181

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig. II.4.2. Spectrul în infraro ş u al uleiului de motor 10W4

Fig. II.4.2. Spectrul în infraroşu al uleiului de motor 10W4 [5]

La energii mult mai înalte (lungimi de undă în vizibil şi ultraviolet) au loc tranziţii de electroni la diferite nivele. Peste acestea se suprapun tranziţiile rotaţionale şi vibraţionale, figura II.4.1.(C). Deşi toate tranziţiile au loc în paşi cuantificaţi, corespunzător unor lungimi de undă discrete şi aici numărul de linii este extrem de mare pentru a da un spectru de linii clar. Ca atare şi în cazul tranziţiilor electronice apare un spectru de benzi largi ale lungimilor de undă absorbite. În figura II.4.2. este reprezentat informativ un spectru în infraroşu, iar în figura II.4.3. este reprezentat un spectru de absorbţie în domeniul ultraviolet – vizibil. Discuţiile la acest capitol au fost limitate la molecule deoarece majoritatea spectrelor de absorbţie din soluţii sînt moleculare. In cazul atomilor singulari, care apar în flacără sau în arc electric, au loc numai tranziţii electronice (aceştia nu se rotesc şi nu vibrează). Liniile corespunzătoare apar ca linii înguste clare. Aspectele legate de tranziţiile pur electronice s-au discutat la capitolul II.1.1.2

182

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig II.4.3. Spectrul în vizibil al unei solu ţ ii de permanganat

Fig II.4.3. Spectrul în vizibil al unei soluţii de permanganat de potasiu de concentraţie cunoscută [5]

Viaţa stărilor excitate ale moleculelor este destul de scurtă ceea ce face ca moleculele să revină la starea fundamentală stabilă din punct de vedere energetic. De multe ori, revenirea pe starea fundamentală se face pe aceeaşi lungime de undă pe care s-a produs emisia ceea ce duce la procese de coliziune al căror rezultat este emisia de căldură. Aceasta caldură este însă greu măsurabilă din cauza nivelului ei scăzut. În schimb emisia de fotoni în domeniul vizibil este sesizată prin culoarea substanţei sau a corpului respectiv. Spectrometria de absorbţie moleculară are aplicaţii atît în analiza calitativă cît şi în cea cantitativă. Se iradiază proba de analizat cu radiaţii de lungimi de undă diferite (de exemplu în domeniul UV-VIS) şi se înregistrează spectrul de absorbţie (intensitatea radiaţiei în funcţie de lungimea de undă, (în infraroşu se înregistrează spectrul în funcţie de numărul de undă). Cu ajutorul spectrului înregistrat şi cu ajutorul unor atlase spectrale se identifică

183

Spectroscopie moleculară UV-VIS

speciile moleculare care se regăsesc în dreptul unei anumite lungimi de undă specifice. La aparatele moderne echipate cu tehnică de calcul şi soft specific identificarea se face automat. Spectrometria în infraroşu foloseşte la ora actuală pe larg identificarea automată a speciilor chimice. La analiza cantitativă se determină concentraţia unei anumite specii chimice pe baza corespondenţei acesteia cu intensitatea radiaţiei absorbite din radiaţia incidentă cu lungimea de undă specifică acelei specii moleculare. Spectrometria moleculară se poate aplica speciilor chimice în stare de agregare lichidă, gazoasă sau solidă. La analiza în stare lichidă, pe fotodetector cade o cantitate de radiaţie monocromatice specifică ce reprezintă diferenţa dintre cantitatea iniţială a radiaţie şi cantitatea radiaţiei absorbite de probă, cea din urmă fiind proporţională cu concentraţia. Analiza gazelor presupune închidere unui volum constant de gaz într-o celulă specială şi fotometrarea acesteia. Spre deosebire de lichide, concentraţia stabilită la analiza cantitativă a gazelor este puternic dependentă de presiune şi de temperatură. De asemenea, dată fiind distanţa mare între molecule, pentru ca metoda să prezinte sensibilitate suficient de bună cuvele au lungimi mari care pot ajunge la valori de ordinul zecilor de centimetrii. Din motivele enumerate mai sus analiza spectrofotometrică a gazelor se efectuează de regulă numai sub forma analizei calitative. Atunci cînd şi analiza cantitativă este totuşi strict necesară se poate alege soluţia barbotării gazelor printr-un mediu chimic lichid a cărui compoziţie este astfel stabilită încît speciile sale chimice să dea reacţii de culoare cu gazele barbotate. La spectrofotometrarea solidelor este analizată cantitatea de radiaţie reflectată de proba solidă supusă analizei. Din cantitatea radiaţiei policromatice incidente va lipsi o cantitatea proporţională cu concentraţiile speciilor chimice prezente în materialul solid, iar în cazul iradierii acestuia cu radiaţie monocromatică va lipsi din cantitatea iniţială a radiaţiei o cantitate proporţională cu concentraţia speciei chimice căreia îi este specifică radiaţia absorbită. La spectrometria de absorbţie moleculară a corpurilor solide trebuie avut în vedere că, dată fiind abaterea macro şi microgeometrică a suprafeţei examinate de la o suprafaţa perfect plană reflexia se realizează şi

184

Spectroscopie moleculară UV-VIS

pe alte direcţii decît direcţia radiaţiei incidente, ca urmare cantitatea de radiaţie ce cade pe detector nu reflectă numai radiaţia absorbită de probă ci şi cantitatea reflectată pe alte direcţii afectînd sensibilitatea şi precizia determinării. În principiu, reflexia poate fi totală, parţială sau inexistentă. Un corp care reflectă total lumina albă apare opac şi de culoare albă, dacă un corp nu reflectă lumina (aceasta este total absorbită) corpul apare de culoare neagră şi este opac, iar dacă un corp reflectă parţial lumina albă (aceasta este parţial absorbită) acesta apare colorat în culoarea complementară culorii absorbite. În cazul soluţiilor acestea au o anumită culoare pentru că lasă să treacă (transmit) această culoare şi absorb în schimb culoarea complementară. De exemplu, o soluţie este percepută de culoare roşie deoarece soluţia absoarbe culoarea verde şi transmite culoarea complementară (cea roşie), tot în acest sens pentru a măsura absorbţia

Tab.II.4.1. Domeniul spectral UV-VIS, culoarea soluţiei de analizat în domeniul VIS şi culorile complementare

Culoarea transmisă de soluţiei de analizat (vizibilă)

Lumina absorbită (culoarea complementară)

 

Culoarea absorbită de soluţiei de analizat (invizibilă)

Domeniul

 

lungimilor de

undă [nm]

invizibil

Vacuum- ultraviolet

<175

invizibil

Ultraviolet

175-200

mediu

invizibil

ultraviolet

200

-390

galben – verzui

violet
violet

390

- 450

galben

Albastru

435

- 490

185

Spectroscopie moleculară UV-VIS

roşu

verde

490

– 580

albastru

galben

580

- 595

verde - albastrui

orange

595

- 650

verde (albastru-verzui)

roşu

650

- 780

invizibil

Infraroșu

780

fotometrică a unei soluţii roşii cuva cu soluţie trebuie iradiată cu culoare verde cu lungimea de undă de 490 şi 580 nm. În tabelul II.4.1. sînt prezentate culorile vizibile ale soluţiilor substanţelor colorate precum şi culoarea complementară ( nevizibilă) absorbită de acestea.

II.4.2. Spectrofotometrie derivativă

La spectrofotometria derivativă spectrele sînt reprezentări grafice ale derivatei a 1-a, a 2-a sau superioare ale absorbţiei sau transmisiei în funcţie de lungimea de undă. Aceste reprezentări permit obţinerea unor detalii spectrale imposibil de observat la reprezentarea clasică a spectrului. De asemenea, la analiza diferenţială nu este nevoie de curbă de etalonare, iar concentraţia se poate determina mai exact în prezenţa unor factori perturbatori. Avantajul interpretării cu derivata 1-a, derivata a 2-a sau derivate superioare iese în evidenţă în mod deosebit la molecule de dimensiuni mari care provoacă o împrăştiere avansată a radiaţiei cee ce are ca efect spectrograme cu peak-uri distribuite pe un cîmp larg care acoperă spectre individuale de legături făcînd imposibilă identificarea calitativă precisă a componentelor substanţei de analizat. În figura II.4.4. este reprezentat principiul spectrofotometriei derivative [1]. Se pleacă de la spectrul a de absorbție, figura II.4.5 a, pentru care legea Lambert - Beer are espresia:

186

Spectroscopie moleculară UV-VIS

A = a × b × c

(II.4.1)

radiaţiei purtătoare a spectrului, iar traseul reprezentat cu linie punctată reprezintă traseul optic pentru fotografierea scării cu lungimi de undă 13, pe placa fotografică 10. După ce cad pe oglinda plană de reflexie 5, radiaţiile sînt trimise spre segmentul inferior 7 al oglinzii

iile sînt trimise spre segmentul inferior 7 al oglinzii Fig.II.4.4. Principiul spectroscopiei derivative aplicat ă

Fig.II.4.4. Principiul spectroscopiei derivative aplicată la două entităţi moleculare cu spectre suprapuse

ă la dou ă entit ăţ i moleculare cu spectre suprapuse Fig.II.4.5. Spectre de absorb ţ

Fig.II.4.5. Spectre de absorbţie pentru

suprapuse Fig.II.4.5. Spectre de absorb ţ ie pentru albumin ă bovin ă [1] , a- spectrul

albumină bovină [1] ,

a- spectrul normal,

c- spectrul

b-spectrul derivatei a 1-a,

derivatei a 2-a [12]

187

Spectroscopie moleculară UV-VIS

radiaţiei purtătoare a spectrului, iar traseul reprezentat cu linie punctată reprezintă traseul optic pentru fotografierea scării cu lungimi de undă 13, pe placa fotografică 10. După ce cad pe oglinda plană de reflexie 5, radiaţiile sînt trimise spre segmentul inferior 7 al oglinzii Structura aromatică fină nu se poate identifica în spectrul normal, ea devine vizibilă abia în spectrul derivatei a 1-a. Dezavantajul spectrelor diferenţiale îl reprezintă faptul că raportul semnal/zgomot este mai mic decît la spectrele clasice. La majoritatea determinărilor din domeniul ultraviolet şi vizibil raportul semnal/zgomot nu este este însă un factor determinant.

II.4.3. SPECTROFOTOMETRIA MOLECULARĂ UV-VIS

Spectrofotometria (spectrometria) moleculară se ocupă cu analiza calitativă şi cantitativă a spectrelor de absorbţie în domeniul spectral ultraviolet-vizibil (UV-VIS) a substanţelor anorganice sau organice în stare lichidă sau gazoasă. Din cauza faptului că în domeniul UV-VIS nu toate substanţele sau elementele chimice au spectre de absorbţie cu maxime clare analiza calitativă nu este atît de reprezentativă ca cea cantitativă în acest spectru. La analiza cantitativă se procedează la fotometrarea (măsurarea) intensității radiaţiei absorbite la o anumită lungime de undă (ce se găseşte în zona maximului de absorbţie) de unde vine și termenul de fotometrie, aceasta fiind una din cele mai utilizate metode din cadrul analizei instrumentale cantitative la substanţe lichide și cuprinde domeniul ultraviolet şi vizibil. Avantajul fotometriei constă în primul rînd în faptul că permite determinarea concentraţiilor atît a substanţelor anorganice cît şi a substanţelor organice. De asemenea, analizei fotometrice îi sînt specifice precizii, reproductibilităţi şi sensibilităţi ridicate. Limita de detecţie este bună situîndu-se normal între 10 -4 M şi 10 -5 M, iar prin măsuri specifice ea poate fi coborîtă pînă la nivelul de 10 -6 M şi 10 -7 M. În cazul în care substanţa de

188

Spectroscopie moleculară UV-VIS

analizat prezintă absorbţie de radiaţie luminoasă în domeniul vizibil sau ultraviolet fotometria poate fi folosită direct fără transformare de substanţă (ex.permanganat de potasiu, sulfat de cupru, clorură de nichel s.a). Pentru a putea folosi fotometria şi la substanţe ce nu prezintă o absorbţie clară de radiaţie luminoasă pe o anumită lungime de undă (ex. glucoză, urină, albumină, creatinină, aminoacizi), se poate produce o transformare chimică sau enzimatică a substanţei. În cel din urmă caz fie substanţa de analizat este transformată chimic sau biochimic cu reactivi de culoare sau cu enzime într-un produs colorat, fie substanţa de analizat însăşi provoacă reacţii de culoare specifice. Următoarele exemple sînt reprezentative în acest sens:

Ex. 1. La reacţia biuretului, în mediu puternic alcalin, ioni de cupru se depun la legăturile peptidice ale proteinelor rezultînd un complex colorat violet. Intensitatea de colorare a complexului poate fi măsurată la lungimea de undă de 546 nm, absorbţia radiaţiei fiind proporţională cu concentraţia proteinelor Ex.2. La reacţia xantoproteică, tratarea unei proteine care conţine aminoacizi cu nucleu aromatic cu acid azotic concentrat, la cald, duce la nitroderivaţi coloraţi în galben închis. Intensitatea coloraţiei (absorbţia radiaţiei măsurate fotometric) este proportională cu concentraţia proteinelor. Ex.3. La reacţia de identificare a albuminei prin adăugare de bromcrezol amestecului de substanţe se formează un complex verde între albumină şi verde de bromcrezol, iar absorbţia acestui complex, măsurată fotometric, este proporţională cu concentraţia albuminei. Ex.4. La reacţia sulfurii de plumb, aplicabilă proteinelor cu tioaminoacizi (metionină, cisteină) soluţiile de proteine încălzite la fierbere, în prezenţa acetatului bazic de plumb, duc la degajare de hidrogen sulfurat care la rîndul lui dă un precipăitat de sulfură de plumb ce se poate determina turbidimetric sau nefelometric. Ex 5. Acidul uric reduce fosfatul acid de wolfram la un colorant albastru. Absorbţia acestui colorant, măsurată fotometric, este proprţională cu concentraţia de acid uric.

189

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Un alt avantaj al fotometriei față de spectrofotometrie se reflectă în prețul de cost al aparatelor, astfel prețul unui fotometru este sensibil mai mic decît al unui spectrofotometru. Dacă o cuvă paralelipipedică transparentă este umplută cu o soluţie şi iradiată cu lumină atunci o parte din lumină este absorbită de particulele din soluţie (absorbţie), o parte este lăsată să treacă (transmisie) şi o mică parte este împrăstiată, figura II.4.6.

ş i o mic ă parte este împr ă stiat ă , figura II.4.6. Fig.II.4.6. Absorb

Fig.II.4.6. Absorbţia, transmisia şi împrăştierea luminii de către o soluţie

Plecînd de la faptul că lumina împrăştiată reprezintă o parte mică şi constantă din lumina incidentă, absorbţia respectiv transmisia devin funcţii ale numărului de particule existente în soluţie deci funcţii ale concentraţiei acestor particule. Rezultă că prin măsurarea cantităţii de lumină transmisă prin probă se poate determina, prin scăderea ei din radiaţia incidentă, concentraţia particulelor care absorb lumină. În cazul substanţelor lichide, perfect transparente, ce absorb radiaţie electromagnetică în domeniul vizibil sau ultraviolet, procedeul de determinare a concentraţiei pe baza măsurării absorbţiei se face la lungimi de undă bine definite din spectrul de radiaţie, iar procedeul de măsurare se numeşte fotometrie. În cazul procedeul de determinare a concentraţiei suspensiilor de particule solide în medii lichide, pe baza măsurării absorbţiei luminii, procedeul de măsurare poartă denumirea de turbidimetrie sau după caz nefelometrie.

190

Spectroscopie moleculară UV-VIS

II.4.3.1.Spectrul de absorbţie al soluţiilor colorate.

Absorbţia radiaţiiilor electromagnetice de către soluţii depinde de lungimea de undă, fiecare specie chimică avînd un spectru propriu de absorbţie care este o reprezentare grafică a absorbţiei A în funcţie de lungimea de undă λ. Datorită faptului că domeniul coeficientului de absorbţie ε poate varia în limitele a cinci ordine de mărime, se foloseşte adesea

reprezentarea log A sau log ε în funcţie de λ,

vezi şi fig.

log A sau log ε în func ţ ie de λ , vezi ş i fig.

Fig.II.4.7. Punctele caracteristice unui spectru de absorbţie

Culoarea soluţiei este determinată de valoarea λ max căreia îi corespunde un coeficient de absorbţie molar ε max . Substanţe diferite au culori diferite caracterizate prin valori diferite λ max şi ε max . Intensitatea coloraţiei este dată de ε max , iar puritatea culorii de lăţimea benzii de absorbţie definită prin λ 1/2 max - λ 1/2 max , figura II.4.7 Din punct de vedere analitic este de dorit ca lăţimea benzii de absorbţie să fie cît mai îngustă şi ε max cît mai mare.

II.4.3.2. Alegerea lungimii de undă

191

Spectroscopie moleculară UV-VIS

În funcţie de structura moleculară o substanţă absoarbe mai multă sau mai puţină lumină de o anumită lungime de undă. Valoarea lungimii de undă la care se fac măsurătorile fotometrice se alege din spectrul de absorbţie al respectivei substanţe încît să fie satisfăcută condiţia unei absorbţii (absorbanţe) cît mai ridicate ceea ce duce la o sensibilitate maximă a măsurătorii. Atunci cînd o substanţă prezintă mai multe maxime de

Atunci cînd o substan ţă prezint ă mai multe maxime de Fig.II.4.8. Spectrogram ă de absorb

Fig.II.4.8. Spectrogramă de absorbţie

cu două maxime de absorbţie

absorbţie, figura II.4.8, pe lîngă criteriul alegerii lungimii de undă corespunzătoare absorbţiei maxime, în decizia alegerii lungimii de undă intră şi alte criterii, lăţimea benzii de absorbţie influențînd precizia determinării. De exemplu, în cazul spectrului substanţei din figura II.4.8, cu două maxime de absorbţie, este preferată pentru fotometrare lungimea de undă corespunzătoare maximului de absorbţie de valoare mai mică B faţă de cel cu absorbţie de valoare mai mare A. Motivul este acela că în cazul benzii de absorbţie A, lăţimea benzii este foarte mică, o mică imperfecţiune de aparat sau de fixare a lungimii de undă poate duce la erori de măsurare mari. Un exemplu edificator în acest

192

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig.II.4.9. Influen ţ a l ăţ imii mici de band ă asupra

Fig.II.4.9. Influenţa lăţimii mici de bandă asupra coeficientului molar de extincţie

sens este redat în figura II.4.9. O substanţă cu bandă de absorbţie maximă îngustă, în domeniul ultraviolet, la lungimea de undă de 360 nm, are valoarea coeficientului molar de absorbanţă de 6.000 mol -1 · cm -1 pe cînd fixarea eronată la o lungime de undă la 415 nm duce la un coeficient molar de absorbanţă de 3520 mol -1 · cm -1 , ceea ce duce la o eroare mare în cazul în care calculul concentraţiei se face prin metoda folosirii coeficientului molar de absorbanţă. De asemenea, mai trebuie avut în vedere faptul că la substanţe al căror spectru prezintă mai multe maxime de absorbţie, pe lîngă criteriul absorbţiei maxime şi a unei lăţimi de bandă rezonabile trebuie selectate pentru fotometrare de preferință maximele de absorbţie la lungimi mai mari de undă deoarece lungimile de undă mici, în special în domeniul ultraviolet, bogate în energie, pot duce la distrugeri ale integrităţii moleculelor prin reacţii fotochimice.

193

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Atunci cînd nu se cunoaşte lungimea de undă la care absorbţia este maximă, în vederea alegerii lungimii de undă optime de lucru, se folosesc spectrofotometre înregistratoare care scanează şi înregistrează spectrul substanţei de analizat (distribuţia intensităţii de absorbţie fotometrică în funcţie de lungimea de undă) din domeniul ultraviolet pînă în domeniul infraroşu, se identifică pe spectru specia chimică de interes şi se extrapolează pe abscisă valoarea maximă a peak-ului. La ora actuală, aceeaşi funcţie o îndeplinesc spectrometrele cu detector Diode-Array care preiau şi descompun spectral un domeniu larg de lungimi de undă care poate acoperi zona ultravioletă, cea vizibilă şi zona infraroşu apropiat.

II.4.3.3. Alegerea grosimii de strat

Pentru a realiza o grosime de strat constantă sînt folosite cuve paralelepipedice din sticlă optică specială în care se introduce substanţa de analizat. Cu cît este mai lung drumul parcurs de lumină prin cuvă cu atît mai multe entităţi atomice sau moleculare ale speciilor vor fi atinse de acesta şi cu atît mai mare este cantitatea de lumină absorbită, absorbţia crescînd exponenţial cu drumul parcurs de lumină. La analiza statică, grosimea stratului este dată de dimensiunea interioară a cuvei, iar la analiza în curgere de diametrul interior al celulei de curgere. În figura II.4.10 este reprezentată variaţia teoretică a transmitanţei respectiv a absorbanţei în funcţie de grosimea de strat. La alegerea grosimii de strat pentru o anumită aplicaţie trebuie avută în vedere corelarea cu concentraţia pentru asigurarea valabilităţii legii Lambert-Beer, lege care presupune o corespondenţă liniară între absorbanţa optică a soluţiei şi concentraţia, respectiv grosimea de strat. În realitate, corelarea data de Legea Lambert - Beer nu este perfect

194

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig.II.4.10. Reprezentarea sugestiv ă a influen ţ ei transmisiei ş i absorban

Fig.II.4.10. Reprezentarea sugestivă a influenţei transmisiei şi absorbanţei de către grosimea de strat, respectiv de către concentraţie

liniară ci ușor exponenţială, ceea ce presupune folosirea unei grosimi de strat în așa fel încît dependența dintre absorbanța optică A măsurată și

concentrația c a speciei chimice analizate să cadă în zona liniară,

cap. II.4.4.1.). Situaţiile care duc la alegerea unei anumite grosimi de strat apar atunci cînd se constată că proba supusă analizei spectrofotometrice prezintă fie o concentraţie prea mare care o situează în zona neliniară a dependenţei absorbanţă optică-concentraţie, fie atunci cînd proba prezintă o concentraţie prea mică care o situează din punct de vedere al sensibilității surătorii sub limita de detecţie a spectrometrului. În primul caz se alege o cuva cu o grosime de strat mai mică decît cea folosită în mod curent sau

(vezi şi

195

Spectroscopie moleculară UV-VIS

atunci cînd este posibil se diluează controlat soluția analizată. În cazul al doilea se alege o cuva cu grosime de strat mai mare decît cea folosită curent. Pentru determinarea concentraţiilor mici din domeniul urmelor precum şi pentru determinarea concentraţiei gazelor se folosesc totdeauna cuve cu dimensiunea maximă permisă de aparat.

II.4.4.

Analiza

cantitativă

spectrofotometrică

calitativă

şi

Spectrofotometria de absorbţie moleculară are aplicaţii atît în analiza cantitativă cît şi în cea calitativă. Spectrometria de absorbţie moleculară efectuate în cele trei domenii spectrale UV-VIS-IR nu are în schimb aceleași performanțe în ce priveşte analiza calitativă şi cantitativă. Astfel, datorită unor maxime de absorbţie clar delimitate spectral în domeniul UV-VIS, acest domeniu este folosit preponderent în analiza cantitativă. Datorită bogaţiei de informaţii privind identificarea naturii speciilor chimice domeniul IR este folosit preponderent în analiza calitativă şi mai puțin pentru analiza cantitativă deoarece rezoluția de măsurare a suprafeței peak-urilor este mai slabă datorită îngustimii acestora.

Tab.II.4.2. Lungimi de undă şi poziţii ale benzii de absorbţie specifice maximelor

de absorbţie pentru

legături cromofore şi grupări funcţionale în domeniul

spectral ultraviolet şi infraroşu

Domeniul ultraviolet

Domeniul infraroşu

Grupare

Lungime de undă (λ max ) [nm]

Grupare

Poziţia benzii de absorbţie [cm -1 ]

cromoforă

funcţională

C=C

175

C-H

2850-2960

CC

175

=C-H

3020-3100

196

Spectroscopie moleculară UV-VIS

 

195

C=C

1650-1670

223

C-H

3300

 

160

CC

2100-2260

C=O

185

C-Cl

600-800

280

C-Br

500-600

R-NO 2

200

C-I

500

274

O-H

3400-3640

CN

165

C-OH

1050-1150

C=C-C=C

217

C-H

3030

C=C-C=O

220

1600,1500

315

N-H

3310-3500

C=C-CC

220

C-N

1030,1230

230

C=O

1670-1780

 

184

COOH

2500-3100

C

6 H 6

204

CN

2210-2260

 

255

NO 2

1540

În tabelul II.4.2. sînt date lungimi de undă specifice pentru maxime de absorbţie a unor grupări cromofore şi grupări funcţionale pentru domeniul ultraviolet şi infraroşu. Existenţa unor absorbţii la aceste lungimi de undă indică prezenţa respectivelor grupări în substanţa de analizat.

II.4.4.1. Analiza spectrofotometrică cantitativă

În cazul fotometriei de absorbţie diminuarea intensităţii radiaţiei

incidente I 0

depinde de:

- natura speciei sau speciilor chimice analizate, exprimată prin coeficientul molar de absorbție a,

- de grosimea b a stratului de soluție sau de gaz pe care îl traversează aceasta

197

Spectroscopie moleculară UV-VIS

- de concentraţia c a speciei sau speciilor chimice din soluția sau gazul analizat Aceste dependenţe sînt valabile pentru lungimile de undă specifice speciei sau speciilor chimice analizate, condiția fiind ca mediul analizat să fie transparent și omogen și să aibă o temperatură prestabilită și cunoscută. În aceste condiții, scăderea intensităţii radiaţiei incidente I 0 , figura II.4.11, se datoreşte numai absorbţiei soluției lichidului sau

I

0

=

I

a

+

I

absorb ţ iei solu ț iei lichidului sau I 0 = I a + I (II.4.5)

(II.4.5)

Fig.II.4.11. Variația intensității radiației luminoase la trecerea printr-o cuvă transparentă cu soluție

gazului analizat. Din punct de vedere matematic aceste dependenţe sînt descrise de legea Lambert-Beer:

log

I

0 =

a

×

b

×

c

(II.4.6)

I

unde: a - coeficient de absorbţie molar (coeficient de extincţie molar) ce reprezintă o mărime specifică speciei sau speciilor chimice analizate

198

Spectroscopie moleculară UV-VIS

b - grosimea stratului străbătut de radiaţie

c - concentraţia substanţei

Această lege stă la baza analizei cantitative colorimetrice şi fotometrice. Mai trebuie specificat că la folosirea legii Lambert-Beer, pentru determinarea concentrației pe cale fotometrică, se face abstracţie de fenomene fizice precum difuziune, refracţie, polarizare, a căror influență asupra rezultatelor determinărilor de concentrație este minoră. În analiza fotometrică se mai definesc următoarele mărimi :

- Transmitanţa (T) :

T =

I

I

0

(II.4.7)

- Indicele de transmitanţă

- Opacitatea (inversul transmitanţei)

- transmitanţa unui strat cu grosimea de 1 cm.

1

T

=

I

0

I

sau sub formă procentuală :

%T =

I

I

0

 

(II.4.8)

×

100

(II.4.9)

- Absorbanţa

A

-

logaritmul

transmisiei (transmitanţei):

cu

semn

schimbat

(cologaritmul)

al

199

Spectroscopie moleculară UV-VIS

A = - logT

A

=

log

1

T

= log

I 0

I

 

(II.4.10)

=

a

×

b

×

c

(II.4.11)

Absorbanţa (A) = Extincţie (E) = Densitatea optică (D)

Avînd în vedere expresia procentuală a transmitanăei T (ecuaţia II.4.11) se poate scrie pentru absorbanţa A următoarea relaţie:

sau :

A = log

şi :

100

=

%T

log100

-

log%T

A = 2 - log%T

%T = antilog (200 - A)

(II.4.12)

(II.4.13)

(II.4.14)

Relaţiile de mai sus reprezintă de fapt expresia matematică a legii Lambert – Beer. Absorbanţa este aditivă motiv pentru care mai multe straturi din aceeaşi substanţă, cu aceeaşi concentraţie, suprapuse dau o absorbţie totală egală cu suma absorbanţelor parţiale. O aplicaţie importantă a legii Lambert- Beer o constituie determinarea concentraţiei anumitor specii chimice dintr-un amestec lichid solid sau gazos de substanţe. Pentru a putea individualiza această determinare este nevoie de separarea informativă a acelei specii chimice din amestec prin considerarea numai a valorii absorbanţei specifice corespunzătoare lungimii

200

Spectroscopie moleculară UV-VIS

de undă la care acea specie are absorbţie maximă. În acest scop este necesar ca radiaţia incidentă I 0 folosită pentru iradiere să fie monocromatică

0 folosit ă pentru iradiere s ă fie monocromatic ă a) b) Fig.II.4.12. Expresia grafic ă

a)

folosit ă pentru iradiere s ă fie monocromatic ă a) b) Fig.II.4.12. Expresia grafic ă a

b)

Fig.II.4.12. Expresia grafică a tipurilor de dependenţe între Transmitanţa (T), Absorbanţa (A)

, Intensitatea radiaţiei (I) şi grosimea stratului de soluţie exprimat de multiplii de celule standard cu grosimea stratului de 10 mm (b)

cu lungimea de undă corespunzătoare absorbanţei maxime a acelei specii chimice, iar legea Lambert - Beer are expresia:

A

=

a

mol

×

c

mol

×

b

(II.4.15)

În figura II.4.12 este reprezentată expresia grafică a tipurilor de dependenţe între Transmitanţa T, absorbanţa A, intensitatea radiaţiei I şi grosimea b a stratului de soluţie analizată.

Coeficientul de absorbţie molar (a mol ) (denumit și coeficientul de extincție molar (ε mol ) reprezintă raportul dintre absorbanţa (A) şi produsul dintre concentraţia molară (c mol ), ( moli/l) a soluţiei şi grosimea (b) a stratului de soluţie străbătut de radiaţie:

201

Spectroscopie moleculară UV-VIS

a

mol

=

A

c

mol

×

b

(II.4.16)

Coeficientul de absorbţie molar a mol reprezintă o constantă a substanţei absorbante, el caracterizează sensibilitatea unei reacţii de culoare şi limitele de concentraţii între care este posibilă dozarea substanţei prin fotometrie. Mărimea acestui coeficient variază în limite largi. Legea Lambert-Beer este valabilă la toate tipurile de spectroscopie de absorbţie atomică şi moleculară. Pentru o lămurire mai bună a aspectelor legate de legea Lambert- Beer, în figura II.4.13 este reprezentată dependenţa dintre a) transmisia şi concentraţia soluţiei, b) dintre absorbanţă şi concentraţia soluţiei, c) dispunerea gradaţiilor de transmisie şi de absorbanţă pe scara gradată aşa cum apare ea la un spectrofotometru analog. Din compararea celor patru situații reprezentate în figura II.4.10 se observă că efectul creşterii de trei ori a concentraţiei c a soluției analizate asupra transmisiei T, respectiv asupra absorbanţei A este acelaşi ca şi cel al creşterii grosimii (b) a stratului soluţiei de trei ori, constatări care sînt în concordanţă şi cu expresiile grafice din fig.II.4.12-a,b, respectiv figura II.4.13-a, b.

202

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig.II.4.13. Expresia grafic ă a dependentei dintre: transmisia ş i concentra ţ

Fig.II.4.13. Expresia grafică a dependentei dintre: transmisia şi concentraţia soluţiei - a), dintre absorbanţă şi concentraţia soluţiei - b), dispunerea gradaţiilor de transmisie şi de absorbanţă pe scara gradată a unui spectrofotometru analog - c),

În ambele cazuri prezentate mai sus, la determinarea concentraţiei pe cale fotometrică pentru a avea determinare matematică trebuie să existe doar două variabile în expresia legii Lambert - Beer, una dependentă (concentraţia -c) şi una independentă (absorbanţa - A în primul caz) sau grosimea de strat - b în cel de-al doilea caz), ceilalţi parametrii din relaţie trebuind să fie constanţi. Pentru rezoluţie şi sensibilitate ridicată se foloseşte o radiaţie luminoasă cu o bandă spectrală îngustă a cărei lungime de undă trebuie să se plaseaze în zona maximului de absorbţie a speciei de analizat. În cazul în care maximul de absorbţie spectrală nu este cunoscut el se deterrmină din reprezentarea grafică a absorbţiei la diferite lungimi de undă.

II.4.4.1.1. Abateri ale legii Lambert- Beer

203

Spectroscopie moleculară UV-VIS

a cum rezultă din legea Lambert - Beer, pentru o anumită substanţă dată şi o grosime de strat precisă, dependenţa între absorbanța A şi concentraţie c este lineară, figura II.4.14. Această dependenţă este valabilă

însă numai în domeniul concentraţiilor mici de pînă la 10 -2 mol/l. În asemenea soluţii diluate fiecare moleculă a substanţei de analizat absoarbe lumină monocromatică independent de moleculele vecine. La concentraţii mai mari se ajunge la erori importante de măsurare. Determinarea concentraţiei pe cale fotometrică şi la soluţii concentrate constă în diluarea controlată a acestora sau dacă nu este posibil folosirea unor cuve de grosime mai mică. Dimpotrivă, dacă concentraţiile sînt foarte mici, sub limita de detecţie, se folosesc cuve cu grosimea stratului de soluţie mare (pînă la 100 mm la lichide şi sute de mm la gaze) Dacă substanţa analizată îşi modifică proprietăţile fizico-chimice în funcţie de concentraţie apar abateri de la liniaritate, figura II.4.14. Aceste abateri pot avea două cauze: chimice şi fizice. Cauzele chimice sînt generate de modificarea coeficientului molar de extincţie (de absorbţie) ca urmare a apariţiei unor reacţii chimice la diferite concentraţii. Asemenea reacţii deplasează echilibrul chimic, pot apărea complecşi, se modifică indicele de refracţie. Cauzele fizice sînt generate de:

- reflexie şi absorbţie de pe pereţii cuvelor. De regulă, la celule de grosime normală, abaterea de la liniaritate datorată reflexiei este mică şi se poate neglija. La celule de grosime mică a soluţiei această abatere nu mai poate fi neglijată şi este necesară practicarea unor factori de corecţie;

204

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig.II.4.14 . Dependen ţ a absorb ţ iei de concentra ţ ia

Fig.II.4.14. Dependenţa absorbţiei de concentraţia molară

- imposibilitatea asigurării unei radiaţii incidente monocromatice. În situaţia unei radiaţii cu mai multe lungimi de undă în compunere, λ 1 , λ 2 …,.λ n , legea Lambert - Beer este valabilă separat pentru fiecare lungime de undă în parte. Acest lucru duce însă la un coeficient mediu de absorbție molară a mol diferit de coeficientul corespunzător unei anumite lungimi λ de undă;

- variaţii de temperatură. La determinări de mare precizie se lucrează în condiţii termostatate deoarece se face simţită influenţa modificărilor de temperatură asupra indicelui de reflexie, absorbţie şi refracţie;

- turbiditate riducată a probei. La probe tulburi se ajunge la împrăştieri importante ale radiaţiei incidente care sînt percepute de senzorul fotoelectric drept concentraţii ceea ce duce la erori importante de surare;

- domeniul de valabilitate a legii Lambert-Beer se determină experimental pentru fiecare caz în parte prin construirea graficului absorbţiei A sau a transmisiei T în funcţie de concentraţia c;

205

Spectroscopie moleculară UV-VIS

II.4.4.1.2.

Măsurarea absorbanţei şi a transmisiei laborator

în condiţii de

Determinarea absorbanţei A şi a transmisiei T aşa cum sînt ele definite prin relaţiile (II.4.11) și (II.4.14) nu este posibilă în condiţii de laborator datorită faptului că soluţia de analizat este dizolvată de un solvent cu absorbanță optică proprie precum și datorită faptului că la trecerea radiației prin cuva din sticlă apar reflexii și absorbții provocate de pereți acesteia, refracții la traversarea mediilor: aer - sticlă - soluție-sticlă - aer, apar dispersii de radiație provocate de către molecule mari din soluție. În aceste condiţii, valoarea intensităţii radiaţiei absorbite de solvent şi de pereţii cuvei precum şi valoarea intensităţii radiaţiei disipate de pereţii cuvei prin reflexie şi refractie, dispersiile provocate de către moleculele mari din soluție, trebuie scăzută din valoarea intensității radiaţiei incidente, numai aşa valoarea intensității radiaţiei trecute prin proba reflectă corect concentraţia speciei chimice analizate. Nerespectarea acestor realități duce la erori de surare care pot ajunge pînă la 10%. Pentru a putea efectua în condiţii de laborator măsurări corecte de absorbanţă respectiv de transmisie se compară (prin efectuarea unui raport matematic) intensitatea radiației transmise prin solvent I solvent cu intensitatea radiaţiei I proba transmisă prin proba dizolvată în solvent:

A = log

I

solven

t

I

s

=

I

proba

I

p

Prin această tehnică, redată sugestiv și prin figura II.4.15, influențele intensității

(II.4.17)

asupra

206

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Spectroscopie molecular ă UV-VIS Fig. II.4.15 .Tehnica m ă sur ă rii altenative a absorban ț

Fig. II.4.15.Tehnica măsurării altenative a absorbanței optice

radiației trecute prin probă se compensează deoarece majoritatea acestora se regăsesc atît în cuva cu solvent cît și în cuva cu soluție. Din punct de vedere matematic, valoarea influențelor negative de la numitor, relația (II.4.17), se simplifică matematic cu cele de la numărător dînd o valoare apropiată de unu, valoare ce influențează nesemnificativ rezultatul determinărilor cantitative. În felul acesta valoarea absorbanţei A a unei anumite soluții analizate reflectă numai concentratia c şi grosimea b a coloanei de lichid iradiată, iar relația (II.4.17), cu referire la fig. II.4.15, poate fi scrisă ca:

A

=

log

I

s

I

p

= log

I

0

I

(II.4.18)

207

Spectroscopie moleculară UV-VIS

Atît spectrometrele cu afişare analogă cît şi cele cu afişare digitală pot indica, respectiv afişa, rezultatul fotometrării unei soluţii în valori de absorbanţă sau în valori de transmisie. Scara absorbanţei este logaritmică, cu valori cuprinse între 0 şi ¥ , în mod practic valoarea 2 fiind limitativă din punct de vedere a unei rezoluţii acceptabile, iar scara transmisiei este o scară liniară cu valori cuprinse între 0 şi 100%, iar în figura II.4.13 sînt redate grafic cele două scări, la aparatele cu indicare analogă ele reprezintă chiar scările de pe frontul apratului, poziţia acului indicator în timpul unei surări indicînd valoarea absorbanţei sau a transmisiei probei. La aparatele digitale valorile ce descriu aceste două scări sînt memorate în baza de date, valoarea măsurată a fotocurentului detectorului fiind extrapolată electronic pe aceste scări, iar valoarea rezultată ca urmare a extrapolării este afișată digital ca absorbanţă A sau transmisie T. La surarea absorbanţei nu este nevoie de calibrarea aparatului în sensul definirii absorbanţei minime şi a celei maxime, în schimb la măsurarea transmisiei este nevoie de calibrare pentru definirea valorii de transmisie 0 % şi a valorii de transmisie 100%. Pentru definirea valorii zero se introduce un opturator optic în traseul radiaţiei luminoase şi se reglează zgomotul de fond al fotocelulei şi al circuitului electronic cu ajutorul unui potentiometru de pe frontul aparatului pînă cînd este indicată sau afișata pe ecran valoarea 0%. Pentru reglarea valorii de 100% transmisie se îndepartează opturatorul optic din traseul luminos şi se introduce cuva cu solvent în calea radiaţiei luminoase. Pentru reglarea indicării de 100% transmisie există două mijloace, pe de-o parte se deschide şi se închide o diafragmă reglabilă pînă cînd indicaţia este în jur de 100%, pe urmă se ajustează fin dintr-un potenţiometru situat şi el pe frontul aparatului, pînă cind indicaţia aparatului este exact 100% transmisie. După înlocuirea cuvei cu solvent cu cea cu soluţie pe ecran este indicată direct valoarea transmisiei conform relaţiei:

%T =

I

proba

I

p

I

p

=

=

I

solvent

I

0

100

×

100

=

I

p

(II.4.19)

208

Spectroscopie moleculară UV-VIS

II.4.4.1.2.1.

Determinarea concentraţiei condiții de laborator

unei

substanţe

în

Determinarea concentrației unei specii chimice în condiții de laborator folosind legea Lambert-Beer este posibilă prin corelarea acesteia prin intermediul unei curbe de etalonare cu una din mărimile:

- absorbanţa A optică

- grosimea b a stratului soluţiei de analizat În acest scop:

- lungimea de undă a radiaţiei

- natura solventului

- natura substanţei de analizat

- temperatura soluţiei de analizat

- pH-ul soluţiei de analizat

trebuie

cunoscute şi menţinute constant pe toată perioada măsurării.

sura

în care se reuşeşte acest lucru înfluenţează în mare parte

performanţa în fotometria cantitativă.

II.4.4.1.2.1.

Determinarea

concentraţiei

absorbanţei

optice

prin

măsurarea

Cea mai simplă metodă de determinare a concentraţiei pe cale fotometrică este aceea de a compara absorbanţa A a unei soluţii de concentraţie cunoscută a substanţei de analizat cu absorbanţa A x a unei soluţii de concentraţie necunoscută a aceleiaşi substanţe. Este evident că fiind vorba de aceeaşi substanţă absorbanţele molare sînt identice, iar substanţa analizată trebuie să aibă aceeaşi grosime, ceea ce presupune folosirea de cuve identice. Expresia celor două extincţii este:

209

Spectroscopie moleculară UV-VIS

unde :

A

A

=

x

a

=

mol

×

b

a

mol

×

×

c

b

×

c

x

(II.4.20)

(II.4.21)

a mol - coeficientul de extincţie molară pentru soluţia de concentrație

cunoscută, respectiv

de concentraţie

necunoscută

b

- grosimea

probei din cuvă

c

- concentraţia cunoscută a probei

de referinţă

c x

- concentraţia necunoscută a probei analizate

Prin împărţirea celor două ecuaţii se obţine:

A

a

mol

b ×

× c

=

A

x

a

mol

×

b

×

c

x

(II.4.22)

După simplificarea coeficientului molar şi a grosimii stratului de electrolit care

sînt aceleaşi pentru ambele probe,

ecuaţia de mai sus devine:

A

c

=

A

x

c

x

(II.4.23)

ecuaţie din care se poate calcula concentraţia c x necunoscută prin relaţia:

c x

=

A

x

A

×

c

(II.4.24)

Folosirea calculului concentraţiei prin comparaţie este folosită întotdeauna atunci cînd una dintre componentele sistemului suferă variaţii în timp. De asemenea, ea este valabilă numai atunci cînd dependenţa între absorbanţă şi concentraţie este liniară. În cazul în care această dependenţă este neliniară apar erori de determinare care sînt cu atît mai mari cu cît abaterea

210

Spectroscopie moleculară UV-VIS

de la liniaritate este mai mare. Pentru siguranţa determinării concentraţiei în zona liniară, mai ales dacă este vorba de concentraţii mai mari, se recomandă realizarea unui grafic de etalonare cu concentraţii cunoscute. În domeniul concentraţiilor mici se obţine o dependenţă liniară între absorbanţă şi concentraţie, iar la concentraţii mari dependenţă neliniară. Determinarea concentraţiei necunoscute a probei analizate cu ajutorul curbei de etalonare se face prin extrapolarea absorbanţei măsurate pentru acea probă pe axa abcisei unde se citeşte concentraţia ei. Pentru determinări de precizie se recomandă numai lucrul în zona liniară a curbei de etalonare. La fotometre moderne prevăzute cu microprocesor, perechile de valori absorbţie- concentraţie cu care se realizează