Sunteți pe pagina 1din 52

Spectroscopie molecular UV-VIS

II.4.
SPECTROSCOPIA MOLECULAR

II.4.1. Bazele teoretice


Exista trei procese de baz prin care o molecul poate absoarbi energie:
-

prin rotaie - molecula se rotete dup axe variate, energia de rotaie fiind
la nivele energetice bine definite. Atunci cnd molecula absoarbe energie,
ea poate trece la nivele energetice de rotaie mai ridicate printr-o tranziie
rotaional;
prin vibraie - atomii sau grupele de atomi din interiorul unei molecule
vibreaz relativ unii fa de ceilali. Energia acestor vibraii se gsete i
ea pe nivele energetice precise, cuantificate. Prin absorbia unei cantiti
discrete de energie, molecula se poate ridica la un nivel vibraional mai
ridicat printr-o tranziie vibraional;
pe cale electronic - electronii unei molecule pot s ajung la nivele
energetice mai nalte ca urmare a unei tranziii electronice de pe un nivel
energetic inferior pe un nivel energetic superior (vezi i capitolul II.1.1.2.);

179

Spectroscopie molecular UV-VIS


Toate cele trei modaliti de absorbie a energiei snt cuantificate, ele
presupun absorbii de cuante de energie hn i creterea corespunztoare a
nivelului energetic al moleculei. Aceste tranziii snt ilustrate n figura II.4.1. pe

Fig.II.4.1. Schema de principiu pentru ilustrarea pe baza nivelurilor energetice ale


absorbiei de energie cuantificat de ctre o molecul. A-tranziie rotaional (infrarou
ndeprtat), B- tranzitie vibraional (infrarou apropiat), C-tranziie electronic (vizibil i
ultraviolet). E0-energia strii fundamentale, E1- energia strii excitate

baza modelului nivelurilor energetice. Energiile relative ale celor trei procese
de tranziie ntr-o molecul snt n ordine descresctoare, electronic vibraional -rotaional, astfel:

180

Spectroscopie molecular UV-VIS


-

tranziiile rotaionale au loc la nivele energetice foarte sczute (lungimi de


und mari, specifice microundelor sau infrarou ndeprtat, lungimi de
und ce snt cuprinse ntre 100 mm i 10 cm);
- tranziiile vibraionale necesit energii mai mari i se plaseaz n
domeniul
infrarou apropiat;
- tranziiile electronice necesit energii mult mai mari ceea ce le plaseaz
n domeniul vizibil i ultraviolet;
La temperatura obinuit a mediului se consider c molecula este n starea
energetic cea mai sczut, E0 , denumit stare fundamental. Tranziia pur
rotaional va avea loc numai din aceast stare fundamental, figura
II.4.1.(A). Atunci cnd au loc tranziii pur rotaionale, n spectru vor aprea linii
drepte discrete de absorbie, lungimea de und a fiecrei linii corespunznd
unei tranziii particulare. Din punct de vedere analitic tranziiile rotaionale
pure nu prezint o importan att de mare. Dac energia absorbit crete
(lungimea de und descrete), pe lng tranziiile rotaionale apar i tranziii
vibraionale rezultnd diferite combinaii ale regimului roational vibraional
cu foarte multe valori. Fiecare nivel de rotaie al celui mai sczut nivel
vibraional poate fi excitat la diferite nivele rotaionale ale nivelului vibraional
excitat, figura II.4.1.(B), n plus ar putea exista cteva nivele vibraionale,
fiecare cu un anumit numr de nivele rotaionale. Aceasta conduce la
numeroase tranziii discrete, rezultatul fiind un spectru cu o densitate extrem
de mare de linii astfel nct acestea nu se pot distinge i percepe clar. Din
cauza suprapunerii tranziiilor rotaionale peste cele vibraionale, cu toate c
tranziiile vibraionale snt tot discrete, spectrul de vibraie apare ca o
structur de peak-uri continue n care nu se pot diferenia liniile discrete.
Lungimile de und la care se formeaz aceste peak - uri pot fi puse n
coresponden cu modurile de vibraie n interiorul moleculei. Acestea au loc
in infrarou mijlociu i ndeprtat

181

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig. II.4.2. Spectrul n infrarou al uleiului de motor 10W4 [5]

La energii mult mai nalte (lungimi de und n vizibil i ultraviolet) au


loc tranziii de electroni la diferite nivele. Peste acestea se suprapun tranziiile
rotaionale i vibraionale, figura II.4.1.(C). Dei toate tranziiile au loc n pai
cuantificai, corespunztor unor lungimi de und discrete i aici numrul de
linii este extrem de mare pentru a da un spectru de linii clar. Ca atare i n
cazul tranziiilor electronice apare un spectru de benzi largi ale lungimilor de
und absorbite. n figura II.4.2. este reprezentat informativ un spectru n
infrarou, iar n figura II.4.3. este reprezentat un spectru de absorbie n
domeniul ultraviolet vizibil. Discuiile la acest capitol au fost limitate la
molecule deoarece majoritatea spectrelor de absorbie din soluii snt
moleculare. In cazul atomilor singulari, care apar n flacr sau n arc electric,
au loc numai tranziii electronice (acetia nu se rotesc i nu vibreaz). Liniile
corespunztoare apar ca linii nguste clare. Aspectele legate de tranziiile pur
electronice s-au discutat la capitolul II.1.1.2

182

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig II.4.3. Spectrul n vizibil al unei soluii de permanganat de potasiu


de concentraie cunoscut [5]

Viaa strilor excitate ale moleculelor este destul de scurt ceea ce


face ca moleculele s revin la starea fundamental stabil din punct de
vedere energetic. De multe ori, revenirea pe starea fundamental se face pe
aceeai lungime de und pe care s-a produs emisia ceea ce duce la procese
de coliziune al cror rezultat este emisia de cldur. Aceasta caldur este
ns greu msurabil din cauza nivelului ei sczut. n schimb emisia de fotoni
n domeniul vizibil este sesizat prin culoarea substanei sau a corpului
respectiv.
Spectrometria de absorbie molecular are aplicaii att n analiza
calitativ ct i n cea cantitativ. Se iradiaz proba de analizat cu radiaii de
lungimi de und diferite (de exemplu n domeniul UV-VIS) i se nregistreaz
spectrul de absorbie (intensitatea radiaiei n funcie de lungimea de und,
(n infrarou se nregistreaz spectrul n funcie de numrul de und). Cu
ajutorul spectrului nregistrat i cu ajutorul unor atlase spectrale se identific

183

Spectroscopie molecular UV-VIS


speciile moleculare care se regsesc n dreptul unei anumite lungimi de und
specifice. La aparatele moderne echipate cu tehnic de calcul i soft specific
identificarea se face automat. Spectrometria n infrarou folosete la ora
actual pe larg identificarea automat a speciilor chimice. La analiza
cantitativ se determin concentraia unei anumite specii chimice pe baza
corespondenei acesteia cu intensitatea radiaiei absorbite din radiaia
incident cu lungimea de und specific acelei specii moleculare.
Spectrometria molecular se poate aplica speciilor chimice n stare
de agregare lichid, gazoas sau solid. La analiza n stare lichid, pe
fotodetector cade o cantitate de radiaie monocromatice specific ce
reprezint diferena dintre cantitatea iniial a radiaie i cantitatea radiaiei
absorbite de prob, cea din urm fiind proporional cu concentraia. Analiza
gazelor presupune nchidere unui volum constant de gaz ntr-o celul
special i fotometrarea acesteia. Spre deosebire de lichide, concentraia
stabilit la analiza cantitativ a gazelor este puternic dependent de presiune
i de temperatur. De asemenea, dat fiind distana mare ntre molecule,
pentru ca metoda s prezinte sensibilitate suficient de bun cuvele au
lungimi mari care pot ajunge la valori de ordinul zecilor de centimetrii. Din
motivele enumerate mai sus analiza spectrofotometric a gazelor se
efectueaz de regul numai sub forma analizei calitative. Atunci cnd i
analiza cantitativ
este totui strict necesar se poate alege soluia
barbotrii gazelor printr-un mediu chimic lichid a crui compoziie este astfel
stabilit nct speciile sale chimice s dea reacii de culoare cu gazele
barbotate. La spectrofotometrarea solidelor este analizat cantitatea de
radiaie reflectat de proba solid supus analizei. Din cantitatea radiaiei
policromatice incidente va lipsi o cantitatea proporional cu concentraiile
speciilor chimice prezente n materialul solid, iar n cazul iradierii acestuia cu
radiaie monocromatic va lipsi din cantitatea iniial a radiaiei o cantitate
proporional cu concentraia speciei chimice creia i este specific radiaia
absorbit. La spectrometria de absorbie molecular a corpurilor solide
trebuie avut n vedere c, dat fiind abaterea macro i microgeometric a
suprafeei examinate de la o suprafaa perfect plan reflexia se realizeaz i

184

Spectroscopie molecular UV-VIS


pe alte direcii dect direcia radiaiei incidente, ca urmare cantitatea de
radiaie ce cade pe detector nu reflect numai radiaia absorbit de prob ci
i cantitatea reflectat pe alte direcii afectnd sensibilitatea i precizia
determinrii. n principiu, reflexia poate fi total, parial sau inexistent. Un
corp care reflect total lumina alb apare opac i de culoare alb, dac un
corp nu reflect lumina (aceasta este total absorbit) corpul apare de culoare
neagr i este opac, iar dac un corp reflect parial lumina alb (aceasta
este parial absorbit) acesta apare colorat n culoarea complementar culorii
absorbite. n cazul soluiilor acestea au o anumit culoare pentru c las s
treac (transmit) aceast culoare i absorb n schimb
culoarea
complementar. De exemplu, o soluie este perceput de culoare roie
deoarece soluia absoarbe culoarea verde
i transmite culoarea
complementar (cea roie), tot n acest sens pentru a msura absorbia

Tab.II.4.1. Domeniul spectral UV-VIS, culoarea soluiei de analizat n


domeniul VIS i culorile complementare

Culoarea transmis de
soluiei de analizat (vizibil)

Lumina absorbit
(culoarea complementar)
Culoarea absorbit de
soluiei de analizat
(invizibil)

Domeniul
lungimilor de
und [nm]

invizibil

Vacuum- ultraviolet

<175

invizibil

Ultraviolet
mediu

175-200

invizibil

Ultra ultraviolet

200 -390

galben verzui

violet

390 - 450

galben

Albastru

435 - 490

185

Spectroscopie molecular UV-VIS


rou

verde

490 580

albastru

galben

580 - 595

verde - albastrui

orange

595 - 650

verde (albastru-verzui)

rou

650 - 780

invizibil

Infrarou

780

fotometric a unei soluii roii cuva cu soluie trebuie iradiat cu culoare


verde cu lungimea de und de 490 i 580 nm. n tabelul II.4.1. snt
prezentate culorile vizibile ale soluiilor substanelor colorate precum i
culoarea complementar ( nevizibil) absorbit de acestea.

II.4.2. Spectrofotometrie derivativ


La spectrofotometria derivativ spectrele snt reprezentri grafice ale
derivatei a 1-a, a 2-a sau superioare ale absorbiei sau transmisiei n
funcie de lungimea de und. Aceste reprezentri permit
obinerea unor
detalii spectrale imposibil de observat la reprezentarea clasic a spectrului.
De asemenea, la analiza diferenial nu este nevoie de curb de etalonare,
iar concentraia se poate determina mai exact n prezena unor factori
perturbatori. Avantajul interpretrii cu derivata 1-a, derivata a 2-a sau
derivate superioare iese n eviden n mod deosebit la molecule de
dimensiuni mari care provoac o mprtiere avansat a radiaiei cee ce
are ca efect spectrograme cu peak-uri distribuite pe un cmp larg care
acoper spectre individuale de legturi fcnd imposibil identificarea
calitativ precis a componentelor substanei de analizat. n figura II.4.4.
este reprezentat principiul spectrofotometriei derivative [1]. Se pleac de la
spectrul a de absorbie, figura II.4.5 a, pentru care legea Lambert - Beer are
espresia:

186

Spectroscopie molecular UV-VIS


(II.4.1)
A = abc
radiaiei purttoare a spectrului, iar traseul reprezentat cu linie
punctat reprezint traseul optic pentru fotografierea scrii cu lungimi de
und 13, pe placa fotografic 10. Dup ce cad pe oglinda plan de reflexie
5, radiaiile snt trimise spre segmentul inferior 7 al oglinzii

Fig.II.4.4. Principiul spectroscopiei derivative


aplicat la dou entiti moleculare cu
spectre suprapuse

Fig.II.4.5. Spectre de absorbie pentru


albumin bovin [1] , a- spectrul normal,
b-spectrul derivatei a 1-a, c- spectrul
derivatei a 2-a [12]

187

Spectroscopie molecular UV-VIS


radiaiei purttoare a spectrului, iar traseul reprezentat cu linie punctat
reprezint traseul optic pentru fotografierea scrii cu lungimi de und 13,
pe placa fotografic 10. Dup ce cad pe oglinda plan de reflexie 5,
radiaiile snt trimise spre segmentul inferior 7 al oglinzii
Structura aromatic fin nu se poate identifica n spectrul normal, ea
devine vizibil abia n spectrul derivatei a 1-a. Dezavantajul spectrelor
difereniale l reprezint faptul c
raportul semnal/zgomot este mai mic
dect la spectrele clasice. La majoritatea
determinrilor din domeniul
ultraviolet i vizibil raportul semnal/zgomot nu este este ns un factor
determinant.

II.4.3. SPECTROFOTOMETRIA MOLECULAR UV-VIS


Spectrofotometria (spectrometria) molecular se ocup cu analiza
calitativ i cantitativ a spectrelor de absorbie n domeniul spectral
ultraviolet-vizibil (UV-VIS) a substanelor anorganice sau organice n stare
lichid sau gazoas. Din cauza faptului c n domeniul UV-VIS nu toate
substanele sau elementele chimice au spectre de absorbie cu maxime clare
analiza calitativ nu este att de reprezentativ ca cea cantitativ n acest
spectru. La analiza cantitativ se procedeaz la fotometrarea (msurarea)
intensitii radiaiei absorbite la o anumit lungime de und (ce se gsete
n zona maximului de absorbie) de unde vine i termenul de fotometrie,
aceasta
fiind una
din cele mai utilizate metode din cadrul analizei
instrumentale cantitative la substane lichide i cuprinde domeniul ultraviolet
i vizibil. Avantajul fotometriei const n primul rnd n faptul c permite
determinarea concentraiilor
att a substanelor anorganice ct i a
substanelor organice. De asemenea, analizei fotometrice i snt specifice
precizii, reproductibiliti i sensibiliti ridicate. Limita de detecie este bun
situndu-se normal ntre 10-4 M i 10-5 M, iar prin msuri specifice ea poate
fi cobort pn la nivelul de 10-6 M i 10-7 M. n cazul n care substana de

188

Spectroscopie molecular UV-VIS


analizat prezint absorbie de radiaie luminoas n domeniul vizibil sau
ultraviolet fotometria poate fi folosit direct fr transformare de substan
(ex.permanganat de potasiu, sulfat de cupru, clorur de nichel s.a). Pentru a
putea folosi fotometria i la substane ce nu prezint o absorbie clar de
radiaie luminoas pe o anumit lungime de und (ex. glucoz, urin,
albumin, creatinin, aminoacizi), se poate produce o transformare chimic
sau enzimatic a substanei. n cel din urm caz fie substana de analizat
este transformat chimic sau biochimic cu reactivi de culoare sau cu enzime
ntr-un produs colorat, fie substana de analizat nsi provoac reacii de
culoare specifice. Urmtoarele exemple snt reprezentative n acest sens:
Ex. 1. La reacia biuretului, n mediu puternic alcalin, ioni de cupru
se depun la legturile peptidice ale proteinelor rezultnd un complex colorat
violet. Intensitatea de colorare a complexului poate fi msurat la lungimea
de und de 546 nm, absorbia radiaiei fiind proporional cu concentraia
proteinelor
Ex.2. La reacia xantoproteic, tratarea unei proteine care conine
aminoacizi cu nucleu aromatic cu acid azotic concentrat, la cald, duce la
nitroderivai colorai n galben nchis. Intensitatea coloraiei (absorbia
radiaiei msurate fotometric) este proportional cu concentraia proteinelor.
Ex.3. La reacia de identificare a albuminei prin adugare de
bromcrezol amestecului de substane se formeaz un complex verde ntre
albumin i verde de bromcrezol, iar absorbia acestui complex, msurat
fotometric, este proporional cu concentraia albuminei.
Ex.4. La reacia sulfurii de plumb, aplicabil proteinelor cu
tioaminoacizi (metionin, cistein) soluiile de proteine nclzite la fierbere, n
prezena acetatului bazic de plumb, duc la degajare de hidrogen sulfurat
care la rndul lui d un precipitat de sulfur de plumb ce se poate
determina turbidimetric sau nefelometric.
Ex 5. Acidul uric reduce fosfatul acid de wolfram la un colorant
albastru. Absorbia acestui colorant, msurat fotometric, este proprional
cu concentraia de acid uric.

189

Spectroscopie molecular UV-VIS


Un alt avantaj al fotometriei fa de spectrofotometrie se reflect n
preul de cost al aparatelor, astfel preul unui fotometru este sensibil mai mic
dect al unui spectrofotometru.
Dac o cuv paralelipipedic transparent este umplut cu o soluie i
iradiat cu lumin atunci o parte din lumin este absorbit de particulele din
soluie (absorbie), o parte este lsat s treac (transmisie) i o mic parte
este mprstiat, figura II.4.6.

Fig.II.4.6. Absorbia, transmisia i mprtierea luminii de ctre o soluie

Plecnd de la faptul c lumina mprtiat reprezint o parte mic i


constant din lumina incident, absorbia respectiv transmisia devin funcii
ale numrului de particule existente n soluie deci funcii ale concentraiei
acestor particule. Rezult c prin msurarea cantitii de lumin transmis
prin prob se poate determina, prin scderea ei din radiaia incident,
concentraia particulelor care absorb lumin. n cazul substanelor lichide,
perfect transparente, ce absorb radiaie electromagnetic n domeniul vizibil
sau ultraviolet, procedeul de determinare a concentraiei pe baza msurrii
absorbiei se face la lungimi de und bine definite din spectrul de radiaie, iar
procedeul de msurare se numete fotometrie. n cazul procedeul de
determinare a concentraiei suspensiilor de particule solide n medii lichide,
pe baza msurrii absorbiei luminii, procedeul de msurare poart
denumirea de turbidimetrie sau dup caz nefelometrie.

190

Spectroscopie molecular UV-VIS

II.4.3.1.Spectrul de absorbie al soluiilor colorate.


Absorbia radiaiiilor electromagnetice de ctre soluii depinde de
lungimea de und, fiecare specie chimic avnd un spectru propriu de
absorbie care este o reprezentare grafic a absorbiei A n funcie de
lungimea de und . Datorit faptului c domeniul coeficientului de absorbie
poate varia n limitele a cinci ordine de mrime, se folosete adesea
reprezentarea log A sau log n funcie de , vezi i fig.

Fig.II.4.7. Punctele caracteristice unui spectru de absorbie

Culoarea soluiei este determinat de valoarea max creia i corespunde un


coeficient de absorbie molar max. Substane diferite au culori diferite
caracterizate prin valori diferite max i max . Intensitatea coloraiei este dat
de max , iar puritatea culorii de limea benzii de absorbie definit prin 1/2 max
- 1/2 max , figura II.4.7 Din punct de vedere analitic este de dorit ca limea
benzii de absorbie s fie ct mai ngust i max ct mai mare.

II.4.3.2. Alegerea lungimii de und

191

Spectroscopie molecular UV-VIS

n funcie de structura molecular o substan absoarbe mai mult sau


mai puin lumin de o anumit lungime de und. Valoarea lungimii de
und la care se fac msurtorile fotometrice se alege din spectrul de
absorbie al respectivei substane nct s fie satisfcut condiia unei
absorbii (absorbane) ct mai ridicate ceea ce duce la o sensibilitate maxim
a msurtorii. Atunci cnd o substan prezint mai multe maxime de

Fig.II.4.8. Spectrogram de absorbie cu dou maxime de absorbie

absorbie, figura II.4.8, pe lng criteriul alegerii lungimii


de und
corespunztoare absorbiei maxime, n decizia alegerii lungimii de und intr
i alte criterii, limea benzii de absorbie influennd precizia determinrii. De
exemplu, n cazul spectrului substanei din figura II.4.8, cu dou maxime de
absorbie, este preferat pentru fotometrare lungimea de und
corespunztoare maximului de absorbie de valoare mai mic B fa de cel
cu absorbie de valoare mai mare A. Motivul este acela c n cazul benzii de
absorbie A, limea benzii este foarte mic, o mic imperfeciune de aparat
sau de fixare a lungimii de und poate duce la erori de msurare mari. Un
exemplu edificator n acest

192

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.9. Influena limii mici de band asupra coeficientului molar de extincie

sens este redat n figura II.4.9. O substan cu band de absorbie maxim


ngust, n domeniul ultraviolet, la lungimea de und de 360 nm, are
valoarea coeficientului molar de absorban de 6.000 mol-1 cm-1 pe cnd
fixarea eronat la o lungime de und la 415 nm duce la un coeficient molar
de absorban de 3520 mol-1 cm-1, ceea ce duce la o eroare mare n cazul
n care calculul concentraiei se face prin metoda folosirii coeficientului molar
de absorban. De asemenea, mai trebuie avut n vedere faptul c la
substane al cror spectru prezint mai multe maxime de absorbie, pe lng
criteriul absorbiei maxime i a unei limi de band rezonabile trebuie
selectate pentru fotometrare de preferin maximele de absorbie la lungimi
mai mari de und deoarece lungimile de und mici, n special n domeniul
ultraviolet, bogate n energie,
pot duce la distrugeri ale integritii
moleculelor prin reacii fotochimice.

193

Spectroscopie molecular UV-VIS


Atunci cnd nu se cunoate lungimea de und la care absorbia este
maxim, n vederea alegerii lungimii de und optime de lucru, se folosesc
spectrofotometre nregistratoare care scaneaz i nregistreaz spectrul
substanei de analizat (distribuia intensitii de absorbie fotometric n
funcie de lungimea de und) din domeniul ultraviolet pn n domeniul
infrarou, se identific pe spectru specia chimic
de interes i se
extrapoleaz pe abscis valoarea maxim a peak-ului. La ora actual,
aceeai funcie o ndeplinesc spectrometrele cu detector Diode-Array care
preiau i descompun spectral un domeniu larg de lungimi de und care
poate acoperi zona ultraviolet, cea vizibil i zona infrarou apropiat.

II.4.3.3. Alegerea grosimii de strat


Pentru a realiza o grosime de strat constant snt folosite cuve
paralelepipedice din sticl optic special n care se introduce substana de
analizat. Cu ct este mai lung drumul parcurs de lumin prin cuv cu att mai
multe entiti atomice sau moleculare ale speciilor vor fi atinse de acesta i
cu att mai mare este cantitatea de lumin absorbit, absorbia crescnd
exponenial cu drumul parcurs de lumin. La analiza static, grosimea
stratului
este dat de dimensiunea interioar a cuvei, iar la analiza n
curgere de diametrul interior al celulei de curgere. n figura II.4.10 este
reprezentat variaia teoretic a transmitanei respectiv a absorbanei n
funcie de grosimea de strat. La alegerea grosimii de strat pentru o anumit
aplicaie trebuie avut n vedere corelarea cu concentraia pentru asigurarea
valabilitii legii Lambert-Beer, lege care presupune o coresponden liniar
ntre absorbana optic a soluiei i concentraia, respectiv grosimea de strat.
n realitate, corelarea data de Legea Lambert - Beer nu este perfect

194

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.10. Reprezentarea sugestiv a influenei transmisiei i absorbanei de ctre


grosimea de strat, respectiv de ctre concentraie

liniar ci uor exponenial, ceea ce presupune folosirea unei grosimi de


strat n aa fel nct dependena dintre absorbana optic A msurat i
concentraia c a speciei chimice analizate s cad n zona liniar, (vezi i
cap. II.4.4.1.). Situaiile care duc la alegerea unei anumite grosimi de strat
apar atunci cnd se constat c proba supus analizei spectrofotometrice
prezint fie o concentraie prea mare care o situeaz n zona neliniar a
dependenei absorban optic-concentraie, fie atunci cnd proba prezint
o concentraie prea mic care o situeaz din punct de vedere al sensibilitii
msurtorii sub limita de detecie a spectrometrului. n primul caz se alege o
cuva cu o grosime de strat mai mic dect cea folosit n mod curent sau

195

Spectroscopie molecular UV-VIS


atunci cnd este posibil se dilueaz controlat soluia analizat. n cazul al
doilea se alege o cuva cu grosime de strat mai mare dect cea folosit
curent. Pentru determinarea concentraiilor mici din domeniul urmelor precum
i pentru determinarea concentraiei gazelor se folosesc totdeauna cuve cu
dimensiunea maxim permis de aparat.

II.4.4. Analiza spectrofotometric calitativ i


cantitativ
Spectrofotometria de absorbie molecular are aplicaii att n analiza
cantitativ ct i n cea calitativ. Spectrometria de absorbie molecular
efectuate n cele trei domenii spectrale UV-VIS-IR nu are n schimb aceleai
performane n ce privete analiza calitativ i cantitativ. Astfel, datorit
unor maxime de absorbie clar delimitate spectral n domeniul UV-VIS,
acest domeniu este folosit preponderent n analiza cantitativ. Datorit
bogaiei de informaii privind identificarea naturii speciilor chimice domeniul
IR este folosit preponderent n analiza calitativ i mai puin pentru analiza
cantitativ deoarece rezoluia de msurare a suprafeei peak-urilor este mai
slab datorit ngustimii acestora.
Tab.II.4.2. Lungimi de und i poziii ale benzii de absorbie specifice maximelor
de absorbie pentru legturi cromofore i grupri funcionale n domeniul
spectral ultraviolet i infrarou
Domeniul ultraviolet
Grupare
Lungime
cromofor
de und
(max) [nm]
C=C
175
CC
175

Domeniul infrarou
Grupare
Poziia benzii de
funcional
absorbie [cm-1]
C-H
=C-H

2850-2960
3020-3100

196

Spectroscopie molecular UV-VIS

C=O
R-NO2
CN
C=C-C=C
C=C-C=O
C=C-CC

C6H6

195
223
160
185
280
200
274
165
217
220
315
220
230
184
204
255

C=C
C-H
CC
C-Cl
C-Br
C-I
O-H
C-OH
C-H
N-H
C-N
C=O
COOH
CN
NO2

1650-1670
3300
2100-2260
600-800
500-600
500
3400-3640
1050-1150
3030
1600,1500
3310-3500
1030,1230
1670-1780
2500-3100
2210-2260
1540

n tabelul II.4.2. snt date lungimi de und specifice pentru maxime de


absorbie a unor grupri cromofore i grupri funcionale pentru domeniul
ultraviolet i infrarou. Existena unor absorbii la aceste lungimi de und
indic prezena respectivelor grupri n substana de analizat.

II.4.4.1. Analiza spectrofotometric cantitativ


n cazul fotometriei de absorbie diminuarea intensitii radiaiei
incidente I0 depinde de:
- natura
speciei sau speciilor chimice analizate, exprimat prin
coeficientul molar de absorbie a,
- de grosimea b a stratului de soluie sau de gaz pe care l traverseaz
aceasta

197

Spectroscopie molecular UV-VIS


-

de concentraia c a speciei sau speciilor chimice din soluia sau gazul


analizat
Aceste dependene snt valabile pentru lungimile de und specifice speciei
sau speciilor chimice analizate, condiia fiind ca mediul analizat s fie
transparent i omogen i s aib o temperatur prestabilit i cunoscut.
n aceste condiii, scderea intensitii radiaiei incidente I0, figura II.4.11,
se datorete numai absorbiei soluiei lichidului sau

I0 = Ia + I

(II.4.5)

Fig.II.4.11. Variaia intensitii radiaiei luminoase la


trecerea printr-o cuv transparent cu soluie

gazului analizat. Din punct de vedere matematic aceste dependene snt


descrise de legea Lambert-Beer:

log

unde:

I0
I

= a b c

(II.4.6)

a - coeficient de absorbie molar (coeficient de extincie molar) ce


reprezint o mrime specific speciei sau speciilor chimice
analizate

198

Spectroscopie molecular UV-VIS


b - grosimea stratului strbtut de radiaie
c - concentraia substanei
Aceast lege st la baza analizei cantitative colorimetrice i fotometrice. Mai
trebuie specificat c la folosirea legii Lambert-Beer, pentru determinarea
concentraiei pe cale fotometric, se face abstracie de fenomene fizice
precum difuziune, refracie, polarizare, a cror influen asupra rezultatelor
determinrilor de concentraie este minor.
n analiza fotometric se mai definesc urmtoarele mrimi :
- Transmitana (T) :
T =

(II.4.7)

I0

Indicele de transmitan - transmitana unui strat cu grosimea de 1 cm.


Opacitatea (inversul transmitanei)
1
T

I0

(II.4.8)

sau sub form procentual :


%T =

I
I0

100

(II.4.9)

Absorbana
A logaritmul cu semn schimbat (cologaritmul) al
transmisiei (transmitanei):

199

Spectroscopie molecular UV-VIS


A = - logT
A = log

1
T

= log

(II.4.10)
I0
I

= a b c

(II.4.11)

Absorbana (A) = Extincie (E) = Densitatea optic (D)

Avnd n vedere expresia procentual a transmitanei T (ecuaia II.4.11) se


poate scrie pentru absorbana A urmtoarea relaie:
A = log

100
%T

= log100 - log%T

(II.4.12)

A = 2 - log%T

(II.4.13)

%T = antilog (200 - A)

(II.4.14)

sau :

i :

Relaiile de mai sus reprezint de fapt expresia matematic a legii Lambert


Beer. Absorbana este aditiv motiv pentru care mai multe straturi din
aceeai substan, cu aceeai concentraie, suprapuse dau o absorbie total
egal cu suma absorbanelor pariale.
O aplicaie important a legii Lambert- Beer o constituie determinarea
concentraiei anumitor specii chimice dintr-un amestec lichid solid sau gazos
de substane. Pentru a putea individualiza aceast determinare este nevoie
de separarea informativ a acelei specii chimice din amestec prin
considerarea numai a valorii absorbanei specifice corespunztoare lungimii

200

Spectroscopie molecular UV-VIS


de und la care acea specie are absorbie maxim. n acest scop este
necesar ca radiaia incident I0 folosit pentru iradiere s fie monocromatic

a)
b)
Fig.II.4.12. Expresia grafic a tipurilor de dependene ntre Transmitana (T), Absorbana (A)
, Intensitatea radiaiei (I) i grosimea stratului de soluie exprimat de multiplii de celule
standard cu grosimea stratului de 10 mm (b)

cu lungimea de und corespunztoare absorbanei maxime a acelei specii


chimice, iar legea Lambert - Beer are expresia:

A=a

mol

mol

(II.4.15)

n figura II.4.12 este reprezentat expresia grafic a tipurilor de dependene


ntre Transmitana T, absorbana A, intensitatea radiaiei I i grosimea b
a stratului de soluie analizat.
Coeficientul de absorbie molar (amol) (denumit i coeficientul de
extincie molar (mol) reprezint raportul dintre absorbana (A) i produsul
dintre concentraia molar (cmol), ( moli/l) a soluiei i grosimea (b) a stratului
de soluie strbtut de radiaie:

201

Spectroscopie molecular UV-VIS


a

mol

A
c

mol

(II.4.16)

Coeficientul de absorbie molar amol reprezint o constant a


substanei absorbante, el caracterizeaz sensibilitatea unei reacii de
culoare i limitele de concentraii ntre care este posibil dozarea
substanei prin fotometrie. Mrimea acestui coeficient variaz n limite
largi. Legea Lambert-Beer
este valabil
la toate
tipurile de
spectroscopie de absorbie atomic i molecular. Pentru o lmurire mai
bun a aspectelor legate de legea Lambert- Beer, n figura II.4.13 este
reprezentat
dependena dintre a) transmisia i concentraia soluiei,
b) dintre absorban i concentraia soluiei, c) dispunerea gradaiilor
de transmisie i de absorban pe scara gradat aa cum apare ea la
un spectrofotometru analog. Din
compararea
celor patru situaii
reprezentate n figura II.4.10 se observ c efectul creterii de trei ori a
concentraiei c a soluiei analizate asupra transmisiei T, respectiv asupra
absorbanei A este acelai ca i cel al creterii grosimii (b) a stratului
soluiei de trei ori, constatri care snt n concordan i cu expresiile
grafice din fig.II.4.12-a,b, respectiv figura II.4.13-a, b.

202

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.13. Expresia grafic a dependentei dintre: transmisia i concentraia soluiei - a),


dintre absorban i concentraia soluiei - b), dispunerea gradaiilor de transmisie i de
absorban pe scara gradat a unui spectrofotometru analog - c),

n ambele cazuri prezentate mai sus, la determinarea concentraiei pe cale


fotometric pentru a avea determinare matematic trebuie s existe doar
dou variabile n
expresia legii Lambert - Beer, una dependent
(concentraia -c) i una independent (absorbana - A n primul caz) sau
grosimea de strat - b n cel de-al doilea caz), ceilali parametrii din relaie
trebuind s fie constani. Pentru rezoluie i sensibilitate ridicat se folosete
o radiaie luminoas cu o band spectral ngust a crei lungime de und
trebuie s se plaseaze n zona maximului de absorbie a speciei de analizat.
n cazul n care maximul de absorbie spectral nu este cunoscut el se
deterrmin din reprezentarea grafic a absorbiei la diferite lungimi de und.

II.4.4.1.1. Abateri ale legii Lambert- Beer

203

Spectroscopie molecular UV-VIS


Aa cum rezult din legea Lambert - Beer, pentru o anumit substan
dat i o grosime de strat precis, dependena ntre absorbana A i
concentraie c este linear, figura II.4.14. Aceast dependen este valabil
ns numai n domeniul concentraiilor mici de pn la 10-2 mol/l. n asemenea
soluii diluate fiecare molecul a substanei de analizat absoarbe lumin
monocromatic independent de moleculele vecine. La concentraii mai mari
se ajunge la erori importante de msurare. Determinarea concentraiei pe
cale fotometric i la soluii concentrate const n diluarea controlat a
acestora sau dac nu este posibil folosirea unor cuve de grosime mai mic.
Dimpotriv, dac concentraiile snt foarte mici, sub limita de detecie, se
folosesc cuve cu grosimea stratului de soluie mare (pn la 100 mm la
lichide i sute de mm la gaze)
Dac substana analizat i modific proprietile fizico-chimice n
funcie de concentraie apar abateri de la liniaritate, figura II.4.14. Aceste
abateri pot avea dou cauze: chimice i fizice. Cauzele chimice snt generate
de modificarea coeficientului molar de extincie (de absorbie) ca urmare a
apariiei unor reacii chimice la diferite concentraii. Asemenea reacii
deplaseaz echilibrul chimic, pot aprea compleci, se modific indicele de
refracie. Cauzele fizice snt generate de:
- reflexie i absorbie de pe pereii cuvelor. De regul, la celule de grosime
normal, abaterea de la liniaritate datorat reflexiei este mic i se poate
neglija. La celule de grosime mic a soluiei aceast abatere nu mai poate
fi neglijat i este necesar practicarea unor factori de corecie;

204

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.14. Dependena absorbiei de concentraia molar

imposibilitatea asigurrii unei radiaii incidente monocromatice. n situaia


unei radiaii cu mai multe lungimi de und n compunere, 1 , 2 ,.n ,
legea Lambert - Beer este valabil separat pentru fiecare lungime de
und n parte. Acest lucru duce ns la un coeficient mediu de absorbie
molar amol diferit de coeficientul corespunztor unei anumite lungimi
de und;
variaii de temperatur. La determinri de mare precizie se lucreaz n
condiii termostatate deoarece se face simit influena modificrilor de
temperatur asupra indicelui de reflexie, absorbie i refracie;
turbiditate riducat a probei. La probe tulburi se ajunge la mprtieri
importante ale radiaiei incidente care snt percepute de senzorul
fotoelectric drept concentraii ceea ce duce la erori importante de
msurare;
domeniul de valabilitate a legii Lambert-Beer se determin experimental
pentru fiecare caz n parte prin construirea graficului absorbiei A sau a
transmisiei T n funcie de concentraia c;

205

Spectroscopie molecular UV-VIS

II.4.4.1.2. Msurarea absorbanei i a transmisiei


laborator

n condiii de

Determinarea absorbanei A i a transmisiei T aa cum snt ele


definite prin relaiile (II.4.11) i (II.4.14) nu este posibil n condiii de
laborator datorit faptului c soluia de analizat este dizolvat de un
solvent cu absorban optic proprie precum i datorit faptului c la trecerea
radiaiei prin cuva din sticl apar reflexii i absorbii provocate de perei
acesteia, refracii la traversarea mediilor: aer - sticl - soluie-sticl - aer,
apar dispersii de radiaie provocate de ctre molecule mari din soluie. n
aceste condiii, valoarea intensitii radiaiei absorbite de solvent i de pereii
cuvei precum i valoarea intensitii radiaiei disipate de pereii cuvei prin
reflexie i refractie, dispersiile provocate de ctre moleculele mari din soluie,
trebuie sczut din valoarea intensitii
radiaiei incidente, numai aa
valoarea intensitii radiaiei trecute prin proba reflect corect concentraia
speciei chimice analizate. Nerespectarea acestor realiti duce la erori de
msurare care pot ajunge pn la 10%. Pentru a putea efectua n condiii de
laborator msurri corecte de absorban respectiv de transmisie
se
compar (prin efectuarea unui raport matematic) intensitatea radiaiei
transmise prin solvent Isolvent cu intensitatea radiaiei Iproba transmis prin
proba dizolvat n solvent:

I
A = log solvent =
I proba

Is
Ip

(II.4.17)

Prin aceast tehnic, redat sugestiv i prin figura II.4.15, influenele asupra
intensitii

206

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig. II.4.15.Tehnica msurrii altenative a absorbanei optice

radiaiei trecute prin prob se compenseaz deoarece majoritatea acestora


se regsesc att n cuva cu solvent ct i n cuva cu soluie. Din punct de
vedere matematic, valoarea influenelor negative
de la numitor, relaia
(II.4.17), se simplific matematic cu cele de la numrtor dnd o valoare
apropiat de
unu, valoare ce influeneaz
nesemnificativ rezultatul
determinrilor cantitative. n felul acesta valoarea absorbanei A a unei
anumite soluii analizate reflect numai concentratia c i grosimea b a
coloanei de lichid iradiat, iar relaia (II.4.17), cu referire la fig. II.4.15, poate
fi scris ca:
I
I
A = log s = log 0
Ip
I

(II.4.18)

207

Spectroscopie molecular UV-VIS


Att spectrometrele cu afiare analog ct i cele cu afiare digital
pot indica, respectiv afia, rezultatul fotometrrii unei soluii n valori de
absorban sau n valori de transmisie. Scara absorbanei este logaritmic,
cu valori cuprinse ntre 0 i , n mod practic valoarea 2 fiind limitativ din
punct de vedere a unei rezoluii acceptabile, iar scara transmisiei este o
scar liniar cu valori cuprinse ntre 0 i 100%, iar n figura II.4.13
snt
redate grafic cele dou scri, la aparatele cu indicare analog ele reprezint
chiar scrile de pe frontul apratului, poziia acului indicator n timpul unei
msurri
indicnd valoarea absorbanei sau a transmisiei probei. La
aparatele digitale valorile ce descriu aceste dou scri snt memorate n
baza de date, valoarea
msurat
a fotocurentului detectorului fiind
extrapolat electronic pe aceste scri, iar valoarea rezultat ca urmare a
extrapolrii este afiat digital ca absorban A sau transmisie T.
La
msurarea absorbanei nu este nevoie de calibrarea aparatului n sensul
definirii absorbanei minime i a celei maxime, n schimb la msurarea
transmisiei este nevoie de calibrare pentru definirea valorii de transmisie 0
% i a valorii de transmisie 100%. Pentru definirea valorii zero se introduce
un opturator optic n traseul radiaiei luminoase i se regleaz zgomotul de
fond al fotocelulei i al circuitului electronic cu ajutorul unui potentiometru de
pe frontul aparatului pn cnd este indicat sau afiata pe ecran valoarea
0%. Pentru reglarea valorii de 100% transmisie se ndeparteaz opturatorul
optic din traseul luminos i se introduce cuva cu solvent n calea radiaiei
luminoase. Pentru reglarea indicrii de 100% transmisie exist dou mijloace,
pe de-o parte se deschide i se nchide o diafragm reglabil pn cnd
indicaia este n jur de 100%,
pe urm se ajusteaz fin dintr-un
poteniometru situat i el pe frontul aparatului, pn cind indicaia aparatului
este exact 100% transmisie. Dup nlocuirea cuvei cu solvent cu cea cu
soluie pe ecran este indicat direct valoarea transmisiei conform relaiei:

%T =

I proba
I solvent

Ip
I0

Ip
100

100 = I p

(II.4.19)

208

Spectroscopie molecular UV-VIS

II.4.4.1.2.1.

Determinarea concentraiei
condiii de laborator

unei

substane

Determinarea concentraiei unei specii chimice n condiii de laborator


folosind legea Lambert-Beer este posibil prin corelarea acesteia prin
intermediul unei curbe de etalonare cu una din mrimile:
- absorbana A optic
- grosimea b a stratului soluiei de analizat
n acest scop:
- lungimea de und a radiaiei
- natura solventului
- natura substanei de analizat
- temperatura soluiei de analizat
- pH-ul soluiei de analizat
trebuie cunoscute i meninute constant pe toat perioada msurrii.
Msura n care se reuete acest lucru nflueneaz n mare parte
performana n fotometria cantitativ.

II.4.4.1.2.1.

Determinarea
concentraiei
absorbanei optice

prin

msurarea

Cea mai simpl metod de determinare a concentraiei pe cale


fotometric este aceea de a compara absorbana A a unei soluii de
concentraie cunoscut a substanei de analizat cu absorbana Ax a unei
soluii de concentraie necunoscut a aceleiai substane. Este evident c
fiind vorba de aceeai substan absorbanele molare snt identice, iar
substana analizat trebuie s aib aceeai grosime, ceea ce presupune
folosirea de cuve identice. Expresia celor dou extincii este:

209

Spectroscopie molecular UV-VIS

A=a

mol

bc

A x = amol b c x

(II.4.20)
(II.4.21)

unde :
amol - coeficientul de extincie molar pentru soluia de concentraie
cunoscut, respectiv de concentraie necunoscut
b - grosimea probei din cuv
c - concentraia cunoscut a probei de referin
cx - concentraia necunoscut a probei analizate
Prin mprirea celor dou ecuaii se obine:
A
Ax

a mol b c

a mol b c x

(II.4.22)

Dup simplificarea coeficientului molar i a grosimii stratului de electrolit care


snt aceleai pentru ambele probe, ecuaia de mai sus devine:
A
Ax

(II.4.23)

cx

ecuaie din care se poate calcula concentraia cx necunoscut prin relaia:

cx =

Ax
A

(II.4.24)

Folosirea calculului concentraiei prin comparaie este folosit ntotdeauna


atunci cnd una dintre componentele sistemului sufer variaii n timp. De
asemenea, ea este valabil numai atunci cnd dependena ntre absorban
i concentraie este liniar. n cazul n care aceast dependen este
neliniar apar erori de determinare care snt cu att mai mari cu ct abaterea

210

Spectroscopie molecular UV-VIS


de la liniaritate este mai mare. Pentru sigurana determinrii concentraiei n
zona liniar, mai ales dac este vorba de concentraii mai mari, se
recomand realizarea unui grafic de etalonare cu concentraii cunoscute. n
domeniul concentraiilor mici se obine o dependen liniar ntre absorban
i concentraie, iar la concentraii mari dependen neliniar. Determinarea
concentraiei necunoscute a probei analizate cu ajutorul curbei de etalonare
se face prin extrapolarea absorbanei msurate pentru acea prob pe axa
abcisei unde se citete concentraia ei. Pentru determinri de precizie se
recomand numai lucrul n zona liniar a curbei de etalonare. La fotometre
moderne prevzute cu microprocesor, perechile de valori absorbieconcentraie cu care se realizeaz curba de etalonare snt memorate,
extrapolarea efectundu-se automat, aparatul afind numeric valoarea
concentraiei.
Toate valorile msurate snt afectate de imprecizii de msurare mai
mari sau mai mici. Prin metode statistice este posibil exprimarea curbei de
calibrare sub forma unei funcii de calibrare, n acest scop fiind folosit
metoda regresiei liniare, respectiv verificarea concordanei liniaritii prin
metoda celor mai mici ptrate. n cazul general, ecuaia unei drepte cu
intersecia ordonatei ntr-un punct d se poate exprima prin relaia:

y = ax + d

(II.4.25)

Ecuaia curbei de calibrare se poate exprima prin relaia:

A = a c + d

(II.4.26)

unde:
A - absorbana optic
a - coeficientul de absorbie
c - concentraia

211

Spectroscopie molecular UV-VIS


d - punctul de intersecie a ordonatei corespunztor valorii
semnalului rezidual (vezi i cap.I.6, fig.I.2)
Dac snt cunoscute valorile coeficientului de absorbie a i a semnalului
rezidual b, atunci se poate calcula concentraia c pentru fiecare valoare
a absorbanei A folosind legea Lambert Beer:
A = a b c + d

(II.4.27)

unde:
b- grosimea de strat fotometrat
Pentru a stabili msura n care curba de calibrare se nscrie n domeniul
liniar
se determin factorii a i d dup metoda celor mai mici ptrate, iar
din valorile experimentale se determin factorul de corelaie R, factor care
descrie concordana de liniaritatre dintre curba de calibrare experimental i
ecuaia unei drepte. Cu ct factorul de corelaie R este mai aproape de unu
cu att concordana de liniaritate este mai mare, se consider c pentru o
metod analitic acesta ar trebui s fie mai mare de 0,98 [1], [13].

II.4.4.1.2.1.1. Erori posibile la determinarea absorbanei soluiilor


Absorbana final msurat, Amsurat , n cadrul unei determinri pentru o
soluie este o absorban cumulativ i se compune din:
- absorbana Ap a probei de analizat sau a produsului de reacie. n cazul
n care substana de analizat nu prezint absorbie specific se poate
provoca o transformare chimic sau enzimatic a substanei de
analizat ntr-un produs colorat a crui intensitate de absorbie
fotometric este proporional cu concentraia;

212

Spectroscopie molecular UV-VIS


-

absorbana Ac datorat culorii proprii a probei (este vorba de alt


culoare dect culoarea absorbit pentru care se determin dependena
dintre concentraie i extincie);
- absorbana Ar datorat reactivilor;
Absorbana datorat culorii proprii a probei i absorbana datorat
reactivilor denatureaz valoarea real a absorbanei speciilor chimice de
analizat sau a produsului de reacie, ca atare la msurri de mare acuratee
aceste absorbane se scad din valoarea absorbanei globale msurate,
motiv pentru care poart i denumirea de absorbana de compensare. Se
poate scrie:

Amsurat = Aprob + Aculoare proprie + Areactiv

(II.4.28)

Am = Ap + Ac + Ar

(II.4.29)

sau:

Exprimnd grafic se obin dependenele din figura II.4.17.

213

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.17. Componentele absorbanei msurate i succesiunea determinrii n timp a celor


trei componente.
A -fotometrul este reglat la zero, B- se fotometreaz reactivii fr reactivul
de baz, C-se introduce proba ce prezint o culoare individual i se fotometreaz, D-se
adaug reactivul de baz, are loc reacia de culoare dup care se fotometeeaz din nou.

Absorbana final va cuprinde absorbana probei msurate dar i cele dou


absorbane
nedorite de compensare. n figura II.4.18. este dat o
exemplificare grafic n care se compar absorbiile Am finale msurate
pentru dou substane identice cu concentraie identic (absorbia final Am
msurat ar trebui s fie aceeai pentru ambele probe). Dat fiind faptul c
probele au fost obinute ns n condiii diferite se obin valori diferite pentru
absorbiile de compensare ceea ce duce la valori diferite pentru absorbia
final.

214

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.18. Absorbia final pentru dou probe identice, de concentraii identice,


obinute n condiii diferite.

Cu toate c proba A i proba B au exact aceeai concentraie a substanei


de analizat, la proba B absorbia final msurat prezint o valoare mai mare
dect la proba A. Aceste diferene rezult ns numai din cauza absorbiilor
de compensare. Dac se scade suma valorilor celor dou absorbii de
compensare din valoarea absorbiei finale msurate, rmne numai absorbia
caracteristic substanei analizate care are aceeai valoare pentru ambele
situaii. La msurri cinetice, de obicei, nu este nevoie de compensarea
absorbiei deoarece la acest procedeu se msoar modificrile absorbiei pe
unitate de timp, figura II.4.19.
La msurri cinetice modificarea absorbiei se raporteaz la unitatea
de timp i se determin n timpul desfurrii reaciei. Avnd n vedere c
proba A i proba B n exemplul nostru prezint aceeai concentraie a
substanei de analizat, cele dou reacii se desfoar cu aceeai vitez,
motiv pentru care valoarea final a absorbiei nu este influenat de ctre
absorbiile de compensare. Din motive de timp, de multe ori, se

215

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.19. Msurarea absorbiei n condiii cinetice pentru aceleai probe ca n figura II.4.18.

procedeaz la msurarea absorbiei reactivilor


i ulterior dup reacie a
absorbiei finale sczind prima valoare din ultima. Acest mod de lucru este
unul practic ns pierde din vedere faptul c absorbia reactivilor se poate
modifica. Din acest motiv este mai recomandat etalonarea fotometrul la zero
cu ap distilat sau cu aer i nregistrarea separat, n funcie de valoarea
zero, a absorbiei de compensare i a absorbiei finale,
din diferena
ultimelor dou detrminndu-se absorbia real a substanei analizate.

II.4.4.1.2.2. Determinarea concentraiei prin msurarea grosimii


de strat
La acest procedeu se egalizeaz absorbia soluiei de concentraie
cunoscut cu absorbia soluiei de concentraie necunoscut prin modificarea
grosimii stratului de soluie. La egalizarea intensitilor luminoase transmise
prin cele dou soluii, absorbiile:

216

Spectroscopie molecular UV-VIS

vor fi egale ntre ele:

de unde:

A1 = b1 c1

(II.4.30)

Ax = b x c x

(II.4.31)

A1 = A x = b1 c1 = b x c x

b
c x = 1 c1
bx

(II.4.32)

(II.4.33)

Din relaia de mai sus rezult i principiul determinrii concentraiei cx i


anume determinarea se rezum la msurarea grosimii straturilor b1 i bx,
efectuarea raportului ntre ele i nmulirea raportului cu valoarea
concentraiei c1 cunoscute. Aparatul cu care se fac aceste determinri este
colorimetrul Dubosque, figura II.4.20. Dou fascicule de lumin identice ca
intensitate trec prin stratul de grosime l1 a soluiei cunoscute de concentraie
c1 i prin stratul de grosime lx a soluiei de concentraie cx necunoscut, iar

217

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.4.20. Schema de principiu a colorimetrului Dubosque. 1-cuv cu soluie de concentraie


cunoscut, 2-cuv cu soluie de concentraie necunoscut, 3,4-vergele de sticl, 5-sistem optic
de vizualizare

dup traversarea a dou vergele de sticl transparente 3,4 ajung prin


sistemul optic 5 ntr-un ocular sub forma a dou cmpuri luminoase cu
intensiti diferite. Prin doi tamburi etalonai n mm se pot deplasa cele dou
vergele pn cnd n ocular cele dou cmpuri au aceeai intensitate. Valorile
citite pentru b1 i bx de pe cei doi tamburi se nlocuiesc n relaia II.4.35 cu
care se calculeaz concentraia necunoscut cx. n cazul fotocolorimetriei,
cele dou fascicule cad pe dou fotocelule identice. Diferena celor doi
fotocureni este folosit dup amplificare ntr-o bucl de reglare care
realizeaz deplasarea automat a celor dou vergele pn la egalitatea
fotocurenilor. Valorile de deplasare ale vergelelor snt citite de senzori de
deplasare i transmise automat sistemului de procesare a datelor. Din cauza
construciei mai complicate cu dou canale optice sistemul determinrii

218

Spectroscopie molecular UV-VIS


concentraiei pe baza dependenei ntre concentraie i grosimea de strat nu
s-a impus la scar larg, n practic mult mai extins fiind sistemul
determinrii concentraiei
pe baza dependenei ntre concentraie i
absorbie cu pstrarea constant a grosimii de strat.

II.4.4.1.2.3.
substane

Determinarea concentraiilor

amestecurilor de

Legea Lambert-Beer se poate aplica i la soluii ce conin mai muli


componeni cu condiia ca ntre acetia s nu exist interaciuni. Pentru
exprimarea extinciei E a unei soluii ce conine mai mult de o specie se
poate folosi urmtoarea expresie:

Atotal = A1 + A2 + .... + An = a1 b c1 + a2 b c 2 + .... + an b c n

(II.4.34)

unde :
a1, a2, an - coeficienii de absorbie molari ale speciilor chimice 1,2,
.,n din soluie
c1, c2, cn - concentraiile molare ale speciilor chimice 1,2, ,n n
soluie
b grosimea stratului de soluie analizat
Relaia de mai sus este de fapt expresia matematic a aditivitii absorbanei
unei soluii la o lungime de und dat n funcie de absorbanele substanelor
ce compun soluia. Pentru dou specii absorbante x i y, absorbana
amestecului este dat de relaia:
A = ax b c x + ay b c y

(II.4.35)

unde :

219

Spectroscopie molecular UV-VIS


ax, ay - coeficienii de absorban molar ai substanelor x i y
b - grosimea stratului absorbant
cx,cy - concentraiile celor dou substane din amestec.

Dac se determin absorbana


celor dou substane i absorbana
amestecului lor se obin spectrele din figura II.4.21 n care cu linie continu
snt reprezentate spectrele de absorbie ale celor dou substane pure n
soluie, iar cu linie punctat spectrul de absorbie al

Fig. II.4.21. Spectrele de absorbie ale substanelor pure x i y i spectrul de absorbie


al amestecului x i y, la aceleai concentraii, [5]

220

Spectroscopie molecular UV-VIS


amestecului celor dou substane. Deoarece snt dou substane a cror
concentraie trebuie determinat vor trebui efectuate dou msurtori.
Practic, se aleg dou lungimi de und pentru msurare, una la care are loc
maximul absorbiei pentru substana x(1) i cealalt la care are loc maximul
de absorbie pentru substana y(2). Se poate scrie atunci:
A1 = Ax + Ay = a x b c x + a y b c y
1
1
1
1

(II.4.36)

A2 = Ax + Ay = a x b c x + a y b c y
2
2
2
2

(II.4.37)

unde: A1 i A2 Ax1 i Ay1 Ax2 i Ay2 ax1 i ay1 -

absorbanele amestecului la lungimile de und 1 i 2


absorbanele substanelor x i y la lungimea de und 1
absorbanele substanelor x i y la lungimea de und 2
coeficienii de absorban molar ale substanelor x i y la
lungimea de und 1
ax2 i ay2 - coeficienii de absorban molar ale substanelor x i y la
lungimea de und 2

Cunoscndu-se concentraiile molare ale celor dou soluii pure prin


citirea absorbiilor celor dou soluii la lungimile de und 1 i 2 se determin
extinciile lor molare. Din sistemul de dou ecuaii de mai sus singurele
necunoscute rmn cx i cy care se pot calcula prin gsirea soluiei sistemului.
Dac spectrul substanei x nu se suprapune peste cel al substanei y la
lungimea de und 2, concentraia substanei y poate fi determinat dintr-o
singur citire a absorbiei acesteia la lungimea de und 2. Concentraia
substanei x poate fi apoi calculat din absorbia amestecului la lungimea de
und 1 din care se scade absorbia substanei y la aceeai lungime de und,
aa cum rezult din ecuaiile sistemului. Atunci cnd concentraia unei
substane din amestec este mult mai mare dect a celeilalte absorbia sa va fi
mult mai mare la ambele lungimi de und, astfel nct determinarea
concentraiei celei de a doua substane se va face cu erori. Aparatele

221

Spectroscopie molecular UV-VIS


moderne digitale au ncorporate programe de calcul ce permit determinarea
simultan a concentraiei substanelor din amestec.

II.4.4.2.

Spectrofotometre i fotometre

Un spectrofotometru, figura II.4.22, este format principial dintr-o surs


de lumin 1, un sistem optic pentru producerea luminii monocromatice,
compus din lentile 2, un sistem de fante 3, un sistem

Fig.II.4.22. Schema de principiu a unui fotometru. 1-surs de lumin, 2-lentile colimatoare, 3sistem
de fante, 4-sistem monocromator cu prism, 5-spaiu pentru cuvele cu soluie de
analizat, 6-detector de radiaie luminoas, 7-amplificator, 8-sistem de afiare

monocromator 4 cu reea de difracie sau cu prism, spaiu pentru cuve cu


soluie de referin i cuve pentru soluie de analizat 5, un detector de radiaie
luminoas 6, un amplificator 7 i un sistem de afiare 8.

II.4.4.2.1. Sursa de radiaie


La spectrofotometre se folosesc fie surse de radiaie cu spectru larg
(metale nroite) fie surse de radiaie cu band spectral ngust. Sursele

222

Spectroscopie molecular UV-VIS


de radiaie cu spectru larg emit n mod continuu lumin ntr-un domeniu
ntins de lungimi de und, astfel:
- lampa cu filament de wolfram (tungsten) emite lumin n domeniul
lungimilor de und
cuprinse ntre 300 - 1000 nm. Lampa radiaz cu
intensitate crescnd ncepnd cu 300 nm.
Intensitatea de radiaie crete
progresiv, vezi i fig. II.4.23 . Randamentul acestei lmpi este

Fig. II.4.23. Spectrul unei lmpi cu incandescen

slab n domeniul ultraviolet.


La lmpile obinuite
de wolfram,
la
temperaturile filamentului de cca 3000 K se evapor atomi de wolfram i se
condenseaz
pe sticla
lmpii. Aceste precipitate nu duc numai la
modificarea intensitii luminoase ci i la modificarea spectrului. Din acest
motiv, aceste lmpi se schimb la intervale de timp bine determinate fr a se
atepta arderea filamentului. La lmpile mai moderne cu filament de wolfram
i mediu gazos halogen, cel din urm absoarbe n prima faz aceti atomi, la
rcirea lmpii atomii se condenseaz din nou pe filament n felul acesta ese
evitat formarea unui depozit metalic pe partea interioar a sticlei lmpii.
- lampa cu halogen (lampa din sticl de cuar i vapori de iod) emite n
domeniul 300 - 1000 nm. Aceast lamp prezint o intensitate de
radiaie mai mare dect lampa cu filament de wolfram

223

Spectroscopie molecular UV-VIS


-

lampa cu deuteriu emite n ultraviolet n domeniul lungimilor de und 180


- 360 nm
lampa cu xenon emite fulgere de lumin de mare intensitate n
domeniul lungimilor de und 200 - 1000 nm

II.4.4.2.1.1. Surse de radiaie cu band spectral ngust.


Lmpile din aceast categorie emit lumin pe un domeniu ngust de
lungimi de und. Dac se nclzete mercur sau cadmiu pn la evaporare,
acestea emit un spectru de linii pe lungimi de und bine definite. Lampa cu
vapori de mercur emite pe lungimile de und: 254, 265, 280, 302, 313, 334,
365, 405, 436, 492, 546, 578, 623, 691, figura II.4.24. Sursele de radiaie
cu band spectral ngust prezint, fa de sursele cu band larg,
avantajul unei intensiti mai ridicate precum i avantajul unui domeniu
spectral ngust din care se poate izola fr eforturi mari un domeniu spectral
i mai ngust. Dezavantajul principal este acela c domeniul spectral ngust
emis de aceste surse nu se suprapune totdeauna cu absorbia optim a
substanei analizate.

Fig. II.4.24. Spectrul unei lmpi cu


vapori de mercur

Fig. II.4.25. Distribuia grafic a spectrului pentru lampa


cu incandescen din fig. II.4.23. (linia roie) i spectrul
lmpii cu vapori de mercur din fig. II.4.24. (linia albastr)

224

Spectroscopie molecular UV-VIS


n distribuia grafic a spectrelor de emisie redate n figurile II.4.23 i II.4.24,
linia roie marcheaz spectrul continuu de emisie a lmpii incandescente,
iar liniile albastre individuale lungimile de und bine definite pentru spectrul
de emisie a lmpii cu vapori de mercur.

II.4.4.2.1.2. Obinerea radiaiei monocromatice.


Pentru asigurarea lungimilor de und specifice absorbiei maxime
(absorbia optim) este necesar separarea acesteia din spectrul larg al
luminii vizibile. Aceast separare se poate face cu filtre de absorbie, filtre de
interferen, prisme sau reele de difracie, vezi i cap. II.1.3.3. Date fiind
posibilitile tehnice de obinere a unor reele de difracie performante la
preuri mici, acestea iau ncet locul prismelor n monocromatoare. n figura
II.4.26.
este prezentat schema de principiu
a obinerii luminii
monocromatice pentru un spectrofotometru cu monocromator cu reea de
difracie

Fig.II.4.26. Schema de principiu a monocromatorului cu reea de difracie folosit n fotometrie


1-surs de radiaie policromatic ( lumin alb), 2-reea de difracie, 3,4-lamele fant, 5-cuv
cu soluie de analizat, 6-detector

225

Spectroscopie molecular UV-VIS


De asemenea, datorit posibilitii realizrii de LED-uri cu preuri mici, practic
la orice lungime de und, folosirea acestora
ca surse de radiaii
monocromatice devine tot mai interesant. n aceeai categorie intr i
diodele laser mai ales de cnd acestea snt disponibile sub forma de cip-uri
de tip Diode-Array unde fiecare dioda poate fi activat s emit radiaie
monocromatic pe o lungime de und precis. LED-urile i diodele laser
de mic putere, de dip Diode-Array, au aplicaii n special la spectroscopia de
fluorescen (vezi i cap.II.4.4.), iar diodele laser de putere mijlocie la
spectroscopia Raman (vezi i cap.II.4.5).

II.4.4.2.1.2.1. Limea benzii spectrale.


Segmentul de spectru (puritatea spectral) care este trimis prin cuva
cu substana de analizat depinde n parte de gradul de dispersie al luminii
(calitatea monocromatorului) i n parte de deschiderea fantei din obturatorul
de lumin, figura II.4.27.

226

Spectroscopie molecular UV-VIS

Fig.II.3.27. Influena micorrii fantei (variantele a,b) i a rezoluiei reelei de difracie


(variantele c,d) asupra puritii spectrale a luminii ce trece prin proba de analizat. 1-surs de
radiaie policromatic (lumin alb), 2-reea de difracie, 3,4-lamele fant f- mrimea fantei,
-deschiderea unghiular a radiaiei

Varianta (B) aduce o mbuntire a variantei (A) prin reducerea limii


fantei, iar varianta (D) aduce o mbuntire a variantei (C) printr-o rezoluie
(desfacere mai avansat a lungimilor de und) mai bun.
Rezult c
puritatea spectral este cu att mai nalt cu ct dispersia luminii este mai
bun i cu ct mai ngust este fanta de trecere a luminii. Reducerea
dimensiunii fantei de trecere
are ca urmare i reducerea intensitii
luminoase, ca atare fanta nu se poate micora orict de mult, n caz contrar
fiind afectat sensibilitatea i limita de detecie a aparatului. Tot n acest sens
trebuie avut n vedere c reelele de difracie cu zeci de mii de linii pe mm

227

Spectroscopie molecular UV-VIS


(rezoluie foarte bun) pot acoperi tot domeniul UV-VIS-NIR, totodat ns
rezoluia mai bun (dispersie mare) reduce intensitatea radiaiei ce cade pe
detector i corespunztor scade sensibilitatea metodei i limita de detecie.
Limea de band la prisme i reele de difracie este situat n jurul valorii de
5nm, la filtre de interferen n jurul valorii de 10-20 nm, pe cnd filtrele de
absorbie prezint limi de band mai mari de 30 nm.

II.4.4.2.2. Spaiul pentru prob


Cuva cu soluie de analizat sau cu soluie de referin se introduce
ntr-un spaiu special unde cuva este fixat pe un suport astfel nct ea s
fie corect (perpendicular) poziionat fa de fasciculul luminos. Exist
suporturi individuale i multiple acionate manual sau mecanic. De regul,
cuva se aduce n dreptul traseului luminos printr-o micare de translaie, mai
rar de rotaie. La intrarea fascicului luminos n spaiul pentru cuv exist o
fant care las s treac o cantitate precis de radiaie cu lungimea de und
(banda spectral ngust)
corespunztoare determinrii
concentraiei
speciei chimice analizate. La determinri cinetice temperatura probei joac un
rol esenial. Din acest motiv se procedeaz la termostatarea spaiului pentru
cuv sau a suportului pentru cuv. Pentru o reglare precis a temperaturii,
senzorul din circuitul de reglare a temperaturii trebuie s fie n schimb
obligatoriu situat n soluia din cuv. Trebuie spus c variaia de temperatur
poate influena i extincia deorece coeficientul molar de extincie poate fi
dependent de temperatur. Pentru a reduce influena luminii de mprtiere
pereii spaiului pentru cuv snt vopsii n culori mate sau n culoare neagr.

II.4.4.2.3. Cuve pentru soluie


Exist urmtoarele tipuri de cuve pentru soluia de analizat:

228

Spectroscopie molecular UV-VIS


-

cuv normal
cuv cu absorbie umplere ca la cuva normal, golire prin absorbie cu o
pomp i o capilar
cuv cu circularea n flux continuu a soluiei de analizat

Fig. II.4.28. Tipuri de cuve folosite la spectrofotometre i la fotometre

Prin diverse norme s-a ajuns la cuvele uzuale de form paralelepipedic


cu grosimea stratului analizat de 1 cm, dar snt folosite i cuve cu grosimea
stratului de 0,5 i 0,6 cm (pentru determinarea soluiilor de concentraii mari)
precum i cuve cu grosimi ale stratului de 2 cm (pentru determinarea
soluiilor de concentraii mici). Volumul de umplere pentru cuve normale este
situat n urmtoarele limite:
- cuve macro: > 1000 ml
- cuve mili: 500 ml -1000ml
- cuve micro: 50 -200 ml
Materiale uzuale pentru cuv pot fi: sticl de cuar natural, sticl optic
normal, polimetracrilat de metil, polistiren. La lungimi de und mai mici de
310 nm se folosec n exclusivitate cuve de cuar. O atenie deosebit trebuie
acordat cuvelor sintetice, materialele acestora fiind foarte bune izolatoare

229

Spectroscopie molecular UV-VIS


termice, prenclzirea trebuie realizat la un timp cel puin dublu fa de
cuvele din sticl. Pereii cuvei de soluie produc o mprtiere total de cca
4% din radiaia luminoas incident. Extincia unei cuve goale are o valoare
de cca. 0,080, dac cuva este umplut cu ap distilat pierderile prin reflexie
se reduc la extincii situate n jurul valorii de 0,040. La ora actual, pentru
analiza in situ se folosesc vase speciale de msurare a intensitaii fluxului
luminos, denumite celule de curgere, montate de regula n circuite de tip
by- pass cu fluxul principal de substan de analizat. n funcie de tipul de
aplicaie aceste celule de curgere au diverse geometrii i dimensiuni( vezi i
cap. )

230